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長安故人新蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR 污染 陰性對照個別污染
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如題， 設(shè)置的陰性對照數(shù)個，其中多數(shù)是陰性的結(jié)果，而個別幾個孔就呈現(xiàn)陽性結(jié)果。 而且沒有具體的規(guī)律可循？ 這樣不像是試劑污染呀，氣溶膠也不對，我把其中一個放置空氣中暴露了的是有時候陽性 有時候陰性 難道是加樣槍污染，導(dǎo)致的某個時候操作的不慎導(dǎo)致的？ |
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凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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可能是出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增帶。 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高（大于10mmol/L)、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多（超過30次循環(huán)）有關(guān)。 其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。 再有是：模板(靶基因)核酸的量與純化程度。模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 |
2樓2013-04-19 18:31:30
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3樓2013-10-29 09:41:05
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