夢(mèng)鎖深秋2005

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[交流] 片段連接失敗

我是556bp的片段，連接在PUC19的質(zhì)粒上，用的KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切，轉(zhuǎn)化涂板后質(zhì)粒粗提精提均比原始質(zhì)粒高一點(diǎn)，但PCR驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證均沒有條帶，只有一些二聚體，求解釋！

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1樓 2013-05-03 14:00:33

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gzl9901

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祝福，，祝福祝福，，努力，再努力！再創(chuàng)佳績(jī)！

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2樓2013-05-03 14:48:10

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意孤城_

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夢(mèng)鎖深秋2005(gyesang代發(fā)): 金幣+2, good, 同時(shí)需要減少酶切模板的量，保證載體雙酶切干凈哦！ 2013-05-03 18:06:33
gyesang: 回帖置頂 2013-05-03 18:06:38

轉(zhuǎn)化涂板后質(zhì)粒粗提精提均比原始質(zhì)粒高一點(diǎn) 什么意思？沒切出來就說明片段沒有連接進(jìn)去，能提出來是載體自連的原因，建議酶切載體的時(shí)候加大酶切時(shí)間，保證切干凈，同時(shí)做個(gè)陰性對(duì)照，不加片段，讓載體自連看看和實(shí)驗(yàn)組的差距，如果長(zhǎng)得一樣多，那就不能用

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3樓2013-05-03 16:41:35

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20083630zhan

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夢(mèng)鎖深秋2005(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-05-03 18:06:47

我覺得你應(yīng)該在酶切回收之后先跑一個(gè)電泳看看，你到底是否會(huì)受到目的片段，然后再連接，因?yàn)橛械氖呛竽慊厥盏漠a(chǎn)物太少，或者是根本沒有會(huì)受到，

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4樓2013-05-03 16:49:41

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wangqi1107

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圖片發(fā)過來看看，高一點(diǎn)事什么意思？

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5樓2013-05-03 16:57:55

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3樓: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-03 16:41:35
轉(zhuǎn)化涂板后質(zhì)粒粗提精提均比原始質(zhì)粒高一點(diǎn) 什么意思？沒切出來就說明片段沒有連接進(jìn)去，能提出來是載體自連的原因，建議酶切載體的時(shí)候加大酶切時(shí)間，保證切干凈，同時(shí)做個(gè)陰性對(duì)照，不加片段，讓載體自連看看和實(shí) ...

這是質(zhì)粒精提的電泳圖，第二個(gè)和最后一個(gè)是原始質(zhì)粒。酶切時(shí)間用了4個(gè)小時(shí)呢

2013-04-26（2） - 副本 (2).jpg

[ Last edited by 夢(mèng)鎖深秋2005 on 2013-5-6 at 09:43 ]

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7樓2013-05-06 09:41:21

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5樓: Originally posted by wangqi1107 at 2013-05-03 16:57:55
圖片發(fā)過來看看，高一點(diǎn)事什么意思？

這是精提的電泳圖，maker是5000的，第二個(gè)和最后一個(gè)是原始質(zhì)粒

2013-04-26（2） - 副本 (2).jpg

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8樓2013-05-06 09:42:44

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夢(mèng)鎖深秋2005(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-05-06 12:30:52

有可能是雜菌污染，我之前也出現(xiàn)過這種情況，PCR能P出來，在抗性培養(yǎng)基也能長(zhǎng)起來，酶切大小也對(duì)著，結(jié)果測(cè)序不對(duì)，是被一種雜菌污染了

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9樓2013-05-06 11:28:41

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9樓: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-06 11:28:41
有可能是雜菌污染，我之前也出現(xiàn)過這種情況，PCR能P出來，在抗性培養(yǎng)基也能長(zhǎng)起來，酶切大小也對(duì)著，結(jié)果測(cè)序不對(duì)，是被一種雜菌污染了

你的意思是感受態(tài)里有雜菌，還是在做轉(zhuǎn)化涂板的過程中污染了？

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10樓2013-05-06 13:05:50

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10樓: Originally posted by 夢(mèng)鎖深秋2005 at 2013-05-06 13:05:50
你的意思是感受態(tài)里有雜菌，還是在做轉(zhuǎn)化涂板的過程中污染了？...

搖菌的過程中

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11樓2013-05-07 22:00:03

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我換了一批感受態(tài)，效果挺好，酶切驗(yàn)證時(shí)間換用了兩個(gè)小時(shí)。可能是感受態(tài)的問題吧！

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12樓2013-05-14 09:49:20

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yingying15886樓

2013-05-03 21:13 回復(fù)

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