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[交流]
taqman熒光定量PCR交流
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首先我先說明一下做實(shí)驗(yàn)的目的：要區(qū)分不同的基因型并且定量。在上海輝睿定的探針。引物不管是大濃度的dna還是小濃度都能跑出來，小濃度的能看到引物二聚體。并且也跑過梯度50到60條帶亮度沒有差別。小弟初接觸熒光定量，經(jīng)驗(yàn)不足，希望和大師們多交流一下。圖片是熒光遇到的問題，最后的是對(duì)熒光產(chǎn)物進(jìn)行電泳。 1、我感覺曲線有點(diǎn)兒趴(擴(kuò)增曲線不趴，但是原始曲線很趴，沒有明顯的S型感覺)，有的時(shí)候57度可以跑出來，但是同時(shí)做的54 55的時(shí)候曲線上下抖動(dòng)特別厲害，一直沒有弄清楚什么原因，感覺溫度越低ct值越小。 2、引物我跑過梯度，臨床檢測(cè)的102 左右濃度的樣本， 50℃到60℃都能跑出來，55攝氏度之后的條帶偏亮。做探針實(shí)驗(yàn)一直用的是＞108的樣本，但是ct值比臨床的要高(差至少一個(gè)數(shù)量級(jí)左右)，我怕弱陽性的標(biāo)本檢測(cè)不出來，以后做定量也受影響。 3、個(gè)人感覺探針的Tm值是不是太低了？導(dǎo)致的結(jié)合效率收到影響？是否有必要重新設(shè)計(jì)探針？或者用MGB探針 4、探針能不能靠近下游引物？ 5、探針3端需不需要磷酸化，有時(shí)候有以探針為引物擴(kuò)增出來非特異性條帶 6、探針的5端 配對(duì)實(shí)驗(yàn)影響大不大？ 圖片1.png 圖片2.png 圖片3.png |
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使用Taqman MGB探針進(jìn)行基因突變的熒光定量檢測(cè)，報(bào)告基團(tuán)FAM，淬滅基團(tuán)BHQ。 以10的7次方IU/ml質(zhì)粒為模板，按1%~100%的比例稀釋，但是曲線一直不成線性中間10%~20%這個(gè)比例的CT值一直比32%的小。 前后用了兩個(gè)體系，一個(gè)自己配的，一個(gè)用的Taqman master mix。Taqman master mix曲線很好看，有按比例來，但是產(chǎn)物一直不多。自己配的就是上面說問題，由于實(shí)驗(yàn)需要，我只能用自己配的體系。 求前輩指導(dǎo)��！ |
31樓2015-10-23 11:05:52
簡(jiǎn)單回復(fù)
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