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xuqingchun33銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
pcr引物二聚體
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甲基化pcr的目的產(chǎn)物為100bp，但是總有引物二聚體，TM我已經(jīng)做了梯度了 takala taq酶0.5ul 10xbuffer 2.5ul dNTP 2ul 水 13ul 模版 5ul DMSO 1ul 引物各 0.5ul 25ul體系 預(yù)變性95度5min 各位高手請問我該怎么辦，幫忙給點(diǎn)意見 1.jpg |
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減少PCR產(chǎn)物中引物二聚體的方法: 1從引物自身著手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問題的辦法; 2.可能模板有問題;模板濃度過小，適當(dāng)加大模板量; 3.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度; 4.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引 物二聚體就會消失的;理由:引物可能會發(fā)生發(fā)夾結(jié)構(gòu),自身環(huán)化等結(jié)構(gòu),在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘可使引物變?yōu)閱捂湥詼p少二聚體。不過有人認(rèn)為在 PCR儀上95度變性5min也同樣達(dá)到目的，而且成功試過通過延長退火時(shí)間也可以消除引物二聚體。 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強(qiáng)特異性; 6.PCR反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加TAq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些TAQ酶會將多余的 引物合成為二聚體。 7.增加循環(huán)數(shù); 8.降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度(根據(jù)擴(kuò)增片斷長度 而定，片段長則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些); 9.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mmol/l沒有區(qū)別，則考慮 Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不 對。 10. 以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時(shí)間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50－100倍。 |
10樓2013-05-16 14:21:12
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