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巢式PCR問題
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| 請高手指教：我做巢式PCR做了一周多了，第一輪一直沒有東西，第二輪也沒有東西。（用特異性引物可以擴(kuò)增出來，說明模板沒問題）。退火溫度和模板梯度都做了，但是還是不行�？赡茉蛴心男┠兀� |
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9樓2013-05-18 08:42:56
張文萱
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2樓2013-05-17 16:24:38
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bullfrog325
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4樓2013-05-17 16:58:36
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模板: 海水總DNA，20ng/ul （用物種特異性引物，分別能擴(kuò)增出來約80bp，所以默認(rèn)為模板是可以的，一個(gè)月前提取的DNA） 引物：文獻(xiàn)中經(jīng)典引物，不是本人設(shè)計(jì)，有人做出來，經(jīng)過驗(yàn)證時(shí)可以的 反應(yīng)條件：退火溫度57,55,50度都嘗試過，都沒有擴(kuò)增出來 第一輪引物預(yù)期擴(kuò)增460bp，第二輪預(yù)期擴(kuò)增260bp 預(yù)變性94度 4min 94度 1min 57/55/50度 1min 72度 1min 反應(yīng)做25個(gè)循環(huán)。 72度 7min 反應(yīng)試劑盒：TAKARA Ex Tap酶 Ex Taq 酶 0.25ul 10*buffer 5ul dNTP（2.5Mm） 4ul 模板 5ul 引物 1和2 （濃度20uM) 各1ul 滅菌水 總反應(yīng)體系50ul |
5樓2013-05-17 17:26:37
bullfrog325
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10樓2013-05-18 15:34:10
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