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[求助]
巢式PCR問題
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| 請高手指教:我做巢式PCR做了一周多了,第一輪一直沒有東西,第二輪也沒有東西。(用特異性引物可以擴(kuò)增出來,說明模板沒問題)。退火溫度和模板梯度都做了,但是還是不行?赡茉蛴心男┠兀 |
新蟲 (初入文壇)
木蟲 (正式寫手)
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模板: 海水總DNA,20ng/ul (用物種特異性引物,分別能擴(kuò)增出來約80bp,所以默認(rèn)為模板是可以的,一個月前提取的DNA) 引物:文獻(xiàn)中經(jīng)典引物,不是本人設(shè)計(jì),有人做出來,經(jīng)過驗(yàn)證時(shí)可以的 反應(yīng)條件:退火溫度57,55,50度都嘗試過,都沒有擴(kuò)增出來 第一輪引物預(yù)期擴(kuò)增460bp,第二輪預(yù)期擴(kuò)增260bp 預(yù)變性94度 4min 94度 1min 57/55/50度 1min 72度 1min 反應(yīng)做25個循環(huán)。 72度 7min 反應(yīng)試劑盒:TAKARA Ex Tap酶 Ex Taq 酶 0.25ul 10*buffer 5ul dNTP(2.5Mm) 4ul 模板 5ul 引物 1和2 (濃度20uM) 各1ul 滅菌水 總反應(yīng)體系50ul |
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