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夏天的普洱茶木蟲 (著名寫手)
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[求助]
目的片段和T載體連接后PCR條帶詭異
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| 我的目的片段大概有1200左右，連接到T載體后做藍(lán)白斑篩選，挑取多個(gè)白斑提取質(zhì)粒以后做PCR，結(jié)果P出來3條條帶，分別是500，1500，3000，有人知道這是什么情況嗎？求解答 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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夏天的普洱茶: 金幣+3, ★★★很有幫助 2013-05-22 13:41:22
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推測原因: 1) 不是單菌落擴(kuò)增結(jié)果?! 2) 引物擴(kuò)增不特異!你的引物在片段上和載體上都有,不是載體上引物吧? 建議: 1) 載體說明上應(yīng)該有檢測引物序列RV-M/M13-47,用這對引物擴(kuò)增檢測試一試吧! 2) 或提出質(zhì)粒后直接酶切鑒定,就可以,判定是否含目的基因. 3) 如果就想PCR鑒定,請?jiān)O(shè)定對照或心中有數(shù): 考慮一下你的質(zhì)粒全長多少? 質(zhì)粒全長: pMD19-T 約2700bp+片段1200bp?=3900bp? 空載應(yīng)該擴(kuò)出多大片段?(擴(kuò)增時(shí)可以用空載質(zhì)粒做個(gè)陰性對照) 目的質(zhì)粒應(yīng)該擴(kuò)出多大片段? 設(shè)定對照再分析就容易找出原因! |
13樓2013-05-22 13:15:47
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