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小蟲(chóng)子MM銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
包涵體復(fù)性
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| 包涵體過(guò)鎳柱，并進(jìn)行了尿素梯度透析，6M-0M，請(qǐng)問(wèn)一下，梯度透析之后尿素能除凈嗎，怎么鑒別尿素是否除凈，蛋白是否復(fù)性成功？之后要做抑菌試驗(yàn)的，尿素一定要除去的。希望大家給點(diǎn)意見(jiàn)。 |
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2樓2013-05-22 14:22:58
會(huì)思想的蘆葦
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+1, 謝謝參與 2013-05-23 08:03:04
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+1, 謝謝參與 2013-05-23 08:03:04
| 我也一直在找檢測(cè)尿素是否透析干凈的方法，但一直沒(méi)有找到，不過(guò)正如樓上所說(shuō) 可以根據(jù)透析體積和換液次數(shù)來(lái)計(jì)算，但一定要保證每次透析都透析完全。至于復(fù)性問(wèn)題，可能沒(méi)有那么簡(jiǎn)單，并不是尿素除凈就可以復(fù)性成功，一個(gè)大老難問(wèn)題，透析的時(shí)候可以在buffer里加人精氨酸和谷胱甘肽 |
3樓2013-05-22 14:40:25
不轉(zhuǎn)錄的DNA
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【答案】應(yīng)助回帖
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小蟲(chóng)子MM(amisking代發(fā)): 金幣+4 2013-05-22 21:40:12
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樓上幾位說(shuō)的都很有道理！ 我不知你倒數(shù)第二步的Urea濃度是2M，還是1M？ 打個(gè)比方，假如你倒數(shù)第二步的Urea濃度是1M！你蛋白的體系是20ml，你0M Urea的buffer是2L！ 1）.假如你將20ml含1M Urea的protein復(fù)性到0M Urea的buffer 2L中！你可以計(jì)算一下，你最終體系中的Urea含量應(yīng)該是10mM! 2).假如你將20ml含1M Urea的protein復(fù)性到0M Urea的buffer 1L中，到體系內(nèi)外達(dá)到平衡后再?gòu)?fù)性到0M Urea的buffer 1L中�。ㄒ簿褪菗Q液一次！）你最終Urea的濃度被稀釋50*50=2500倍！也就是最終含有0.4mM的Urea！ 建議你復(fù)性的時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)！一天或者更長(zhǎng)（只是針對(duì)比較復(fù)雜的蛋白復(fù)性來(lái)說(shuō)）！一般蛋白復(fù)性6~7h就夠了！ 并不是所有蛋白復(fù)性都需要加Arg和GSH氧化還原系統(tǒng)！有的蛋白在PBS等緩沖體系中就能復(fù)性！不需要添加任何穩(wěn)定劑的！你添加Arg是增加了protein refolding 的中間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性！但也避免不了你又引入新的干擾因子！Arg可能對(duì)你做科研實(shí)驗(yàn)有一定的影響！所以能不加就不加�。。� 氧化還原系統(tǒng)只是針對(duì)還有二硫鍵的蛋白的renaturation有作用！如果你的protein不含有巰基怎么辦呢？那不是又白加了嗎？？？？（好吧！我扯得太遠(yuǎn)了��！  ）希望以上建議對(duì)你有用！ |
4樓2013-05-22 18:55:07
志子
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5樓2013-05-22 21:37:40
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不知道哪步出問(wèn)題了！請(qǐng)大俠幫幫忙！ 6樓2013-05-24 09:02:48
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來(lái)學(xué)習(xí)的，我們也做變性復(fù)性的，如果是復(fù)性抗體的話(huà)，是否成功好檢測(cè)，但是其他的就不清楚了。根據(jù)我們復(fù)性抗體知道復(fù)性是非常困難的。 第一，復(fù)性條件要具體情況具體分析，尤其是有二硫鍵，氧化還原系統(tǒng)的比例要具體分析并控制。 第二，復(fù)性成功率，即便是能夠找到復(fù)性的條件，但是復(fù)性成功率依舊是個(gè)問(wèn)題，好似一般的在20%左右，當(dāng)然這個(gè)跟蛋白的關(guān)系很大。 第三，透析濃縮，你在變性復(fù)性、透析濃縮中，隨時(shí)間推移，蛋白質(zhì)自身就會(huì)失活，尤其是在透析濃縮中，因?yàn)榈鞍诐舛冉档�，本身失活，透析并不是無(wú)菌環(huán)境，因此會(huì)降解。時(shí)間越久，損失越大，可以通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白降解問(wèn)題。 由上面可以知道，我們這種研究所，一般沒(méi)有特別優(yōu)秀的老師指導(dǎo)及特殊設(shè)備復(fù)性，真正成功并獲取活性的蛋白會(huì)非常非常�。ó�(dāng)然這個(gè)一般的蛋白在無(wú)特殊設(shè)備的情況下很難確定是否復(fù)性成功）。 我是用的可溶性表達(dá)，建議以可溶性表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)條件，或者換載體之類(lèi)的。這種成功的可能性更大。 |
7樓2013-05-24 09:32:20
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【答案】應(yīng)助回帖
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1. 如果你感覺(jué)是你的蛋白有問(wèn)題，建議你先將你的蛋白跑個(gè)SDS-page！檢測(cè)蛋白有木有減少和蛋白濃度夠不夠高！能不能達(dá)到你抑菌試驗(yàn)的要求�。。�！ 2. 如果你感覺(jué)你的蛋白透析的問(wèn)題！是不是你的蛋白中含有什么物質(zhì)干擾你的抑菌試驗(yàn)！你可以看看相關(guān)文獻(xiàn)介紹！ 3.如果蛋白沒(méi)有問(wèn)題！那是不是你的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基出了問(wèn)題，還是你的抗生素有問(wèn)題，或者是你的菌已經(jīng)不能正常生長(zhǎng)了！還有你的菌生長(zhǎng)的最適溫度是不是你的培養(yǎng)溫度！ |
8樓2013-05-24 11:30:10
lwj861228
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9樓2014-07-14 08:47:11
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