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請教一些原核表達的問題。
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| 我現(xiàn)在在做一個基因的轉(zhuǎn)錄本檢測，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了幾個轉(zhuǎn)錄本，都是連接到T載體克隆測序的，下一步想做原核表達，現(xiàn)在我用的是PET-28a載體，上面有Eco I 和 Hind III酶切位點，T載體上也有相應的酶切位點，請問我是不是可以直接雙酶切T載體，然后連接到PET-28a載體上做原核表達？這種做法可行？需要注意一些上面問題呢？ |
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zhoulubin
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8樓2013-08-05 10:57:13
zhoulubin
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首先你這種想法理論上是可行的，但有很大風險 1.你不能保證目的片段連接到T vector上的方向，如果是反向連接，這樣就肯定表達不出目的蛋白； 2.你不能保證從T載體上切下來再和pET28a連接后，讀框沒變。如果讀框變了，也表達不出目的蛋白。 基于這兩點，你這種方法成功的概率相當小。 還是自己在目的片段上添加上酶切位點吧，當然這個酶切位點可以和T Vector上的重復，這不影響。 |
2樓2013-06-18 16:15:42
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不能這么做的，ORF會改變或者多出氨基酸。 設(shè)計帶酶切位點、保護堿基的引物，以連接有目的基因的T載體為模板，用高保真的酶如Pfu進行擴增，PCR產(chǎn)物切膠回收后直接酶切，再連接pET28。 |
3樓2013-06-18 21:23:23
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10樓2013-08-05 16:43:07
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