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hua_geduo木蟲 (正式寫手)
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[求助]
細胞培養(yǎng)的血清問題
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| 細胞培養(yǎng)的血清500ml，沒有完全融化我就把已經融化的部分進行了分裝,拿來使用，是不是這樣的血清不均勻?這樣會不會對細胞有影響？這幾天發(fā)現細胞總會脫落，會不會跟這個有關？ |
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 細胞培養(yǎng) |
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myprayer
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【答案】應助回帖
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵交流 2013-06-30 16:21:41
hua_geduo: 金幣+3, ★有幫助 2013-07-01 20:55:18
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hua_geduo: 金幣+3, ★有幫助 2013-07-01 20:55:18
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這個是細胞培養(yǎng)的一般方法，大概就是這個流程吧 具體的你的問題我再給你說一下 培養(yǎng)基的配置那DMEM為例 先是溶解相應的碳酸氫鈉，然后加入培養(yǎng)基，等充分溶解之后過濾，過濾最好都到無菌環(huán)境中進行， PVDF 0.22um的材質過濾器 然后將你所用的血清加入到已經過濾好的培養(yǎng)基中，稍微輕輕的搖晃讓其均勻，然后分裝在50ML的離心管中這步你看實驗室需求了，這樣分裝的目的能夠減少整體污染。 配置培養(yǎng)基大概就是這樣子的。 再來說說你的問題 你說細胞脫落，是細胞貼壁貼的不好嗎？這個要看你具體是什么細胞了。 下面給你說的是細胞培養(yǎng)的大概步驟 感覺你說的問題就是沒有搞清楚流程，沒見過直接用血清那樣子用的 1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上; 2.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上; 3.培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yǎng)基內,用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物.分裝后置-20度保存; 4.消化液(pH7.8)或其它加入液,應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度保存; 5.培養(yǎng)箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上,如有高溫滅菌的應按程序來菌).至少每月一次. 6.進入操作時應注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時注意無菌臺內空間層次.手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數量較多,培養(yǎng)瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應相隔一定的距離,開瓶(蓋)時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒,開開后應用燈先燒口,然后燒蓋.用完后同樣操作.整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點. 復蘇: 1. 應遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調至37-37.5度,取出凍存的細胞迅速放入后交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化. 2. 2.在無菌臺內將完全培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶內,約5ml左右,然后用無菌吸管從凍存管內取出細胞,置培養(yǎng)并內輕輕搖晃,使細胞均勻后置培養(yǎng)箱內培養(yǎng). 傳代: 1.貼壁細胞: 對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養(yǎng)基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強度減弱.50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進行消化,(根據配制強度經驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2分鐘,鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落后,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml完全培養(yǎng)基后,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內,加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或實驗. 懸浮細胞: 一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),如要高濃度可先離心500rpm,5min后加入完全培養(yǎng)基,輕輕吹勻后,分置其它培養(yǎng)瓶內加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng). [ Last edited by myprayer on 2013-6-30 at 16:02 ] |
2樓2013-06-30 16:00:20
3樓2013-06-30 21:20:25
hua_geduo
木蟲 (正式寫手)
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4樓2013-07-01 20:56:10
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