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hua_geduo木蟲 (正式寫手)
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[求助]
細(xì)胞培養(yǎng)的血清問題
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| 細(xì)胞培養(yǎng)的血清500ml，沒有完全融化我就把已經(jīng)融化的部分進(jìn)行了分裝,拿來使用，是不是這樣的血清不均勻?這樣會(huì)不會(huì)對(duì)細(xì)胞有影響？這幾天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞總會(huì)脫落，會(huì)不會(huì)跟這個(gè)有關(guān)？ |
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 細(xì)胞培養(yǎng) |
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3樓2013-06-30 21:20:25
myprayer
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-06-30 16:21:41
hua_geduo: 金幣+3, ★有幫助 2013-07-01 20:55:18
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這個(gè)是細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法，大概就是這個(gè)流程吧 具體的你的問題我再給你說一下 培養(yǎng)基的配置那DMEM為例 先是溶解相應(yīng)的碳酸氫鈉，然后加入培養(yǎng)基，等充分溶解之后過濾，過濾最好都到無菌環(huán)境中進(jìn)行， PVDF 0.22um的材質(zhì)過濾器 然后將你所用的血清加入到已經(jīng)過濾好的培養(yǎng)基中，稍微輕輕的搖晃讓其均勻，然后分裝在50ML的離心管中這步你看實(shí)驗(yàn)室需求了，這樣分裝的目的能夠減少整體污染。 配置培養(yǎng)基大概就是這樣子的。 再來說說你的問題 你說細(xì)胞脫落，是細(xì)胞貼壁貼的不好嗎？這個(gè)要看你具體是什么細(xì)胞了。 下面給你說的是細(xì)胞培養(yǎng)的大概步驟 感覺你說的問題就是沒有搞清楚流程，沒見過直接用血清那樣子用的 1.玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時(shí)以上; 2.無菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上; 3.培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗(yàn):將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi),用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物.分裝后置-20度保存; 4.消化液(pH7.8)或其它加入液,應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度保存; 5.培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上,如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來菌).至少每月一次. 6.進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時(shí)注意無菌臺(tái)內(nèi)空間層次.手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數(shù)量較多,培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離,開瓶(蓋)時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒,開開后應(yīng)用燈先燒口,然后燒蓋.用完后同樣操作.整個(gè)操作過程盡量在無菌臺(tái)靠里面一點(diǎn). 復(fù)蘇: 1. 應(yīng)遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調(diào)至37-37.5度,取出凍存的細(xì)胞迅速放入后交細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化. 2. 2.在無菌臺(tái)內(nèi)將完全培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),約5ml左右,然后用無菌吸管從凍存管內(nèi)取出細(xì)胞,置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃,使細(xì)胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng). 傳代: 1.貼壁細(xì)胞: 對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸(倒)盡培養(yǎng)基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強(qiáng)度減弱.50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進(jìn)行消化,(根據(jù)配制強(qiáng)度經(jīng)驗(yàn)),晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2分鐘,鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落,加入2-3ml完全培養(yǎng)基后,輕輕吹打,使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮,然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn). 懸浮細(xì)胞: 一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),如要高濃度可先離心500rpm,5min后加入完全培養(yǎng)基,輕輕吹勻后,分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng). [ Last edited by myprayer on 2013-6-30 at 16:02 ] |
2樓2013-06-30 16:00:20
hua_geduo
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4樓2013-07-01 20:56:10
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