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[求助]
菜鳥求助：PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的克�。�？
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書上如是說：在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的DNA片段。 我不明白的地方是，要獲得目的DNA片段就是通過PCR。PCR的產(chǎn)物就是DNA片段，要將產(chǎn)物克隆就是要獲得更多的片段，繼續(xù)PCR不就行了么？？ 我理解的是PCR的產(chǎn)物中只有兩條模板鏈?zhǔn)情L的，其他的都是短的對嗎？可以P出與模板鏈一樣長的鏈嗎？？ 菜鳥問題，大蝦見笑 |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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2樓2013-07-03 00:28:19
3樓2013-07-03 02:02:01
4樓2013-07-04 13:54:51
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金幣+3, 鼓勵新蟲交流 2013-07-09 13:06:06
cly2810: 金幣+2, ★★★★★最佳答案 2013-07-09 16:42:41
kx444555: 金幣+3, 鼓勵新蟲交流 2013-07-09 13:06:06
cly2810: 金幣+2, ★★★★★最佳答案 2013-07-09 16:42:41
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關(guān)于你的這段話的2個問題： 1 PCR就是對目的DNA的富集過程。如果只想做多態(tài)性研究就不必做克隆，但以下情況需要你做克隆：a:要測序的目的片段較短，需要連到載體克隆后測序；b:認(rèn)為目的基因內(nèi)存在雜合位點(diǎn)，堿基的缺失和突變等情況；c:下一步試驗(yàn)的需要，比如需要對目的基因進(jìn)行功能研究 ; 2 既然PCR是目的DNA富集的過程，經(jīng)過30輪左右的指數(shù)定增過程，最終PCR產(chǎn)物中都是您的目的DNA大小的DNA片段。 |
5樓2013-07-08 16:24:52
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2013-07-09 13:06:15
cly2810: 金幣+1, ★有幫助 2013-07-09 16:42:51
kx444555: 金幣+3, 鼓勵交流 2013-07-09 13:06:15
cly2810: 金幣+1, ★有幫助 2013-07-09 16:42:51
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"我理解的是PCR的產(chǎn)物中只有兩條模板鏈?zhǔn)情L的，其他的都是短的對嗎？可以P出與模板鏈一樣長的鏈嗎？？" 除了模板還是原來那么長（排除在反應(yīng)中被降解的理想情況下），還會以線性增長擴(kuò)增一頭是引物，一頭是一直延伸超過目的片段長度的，如果延伸溫度足夠長，會一直延伸到比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為止，然后是以指數(shù)增長擴(kuò)增的兩頭是引物的目的產(chǎn)物，估計(jì)就是你說的短的產(chǎn)物。 一般的PCR用聚合酶不能進(jìn)行超長片段擴(kuò)增，不過，如果模板本身是PCR產(chǎn)物，再次PCR是有可能擴(kuò)增到模板那么長的，按理論說是完全有可能，但實(shí)際試驗(yàn)操作時，還是要進(jìn)行摸索，主要是PCR產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增的條帶以及其他原因抑制擴(kuò)增，通常需要做不同稀釋倍數(shù)的摸索。 |
6樓2013-07-09 08:05:23
7樓2013-10-10 16:09:26
8樓2013-10-10 16:10:05
9樓2013-10-10 16:10:43
【答案】應(yīng)助回帖
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影響PCR的因素很多，而且擴(kuò)增的過程有可能會發(fā)生突變，而克隆得到的質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)增保真率比PCR更高，質(zhì)粒復(fù)制再提取質(zhì)粒獲得完全相同的片段要比直接PCR來得容易也更有保證。而且PCR會有一定的非特異帶非目的帶擴(kuò)增出來，如果得到的片段需要進(jìn)行克隆進(jìn)行表達(dá)或其他功能研究，就需要在克隆后鑒定是否目的帶。 如果只是檢測是否有預(yù)期的片段，直接PCR就可以了，更常見的是實(shí)時定量PCR檢測，不用再進(jìn)行克隆也能達(dá)到某些目的，比如mRNA的轉(zhuǎn)錄水平等。 |
10樓2013-10-11 18:45:47
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