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求助——質(zhì)粒大提跑膠成這樣 已有2人參與
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Marker旁邊那個(gè)長長的東西就是我提取的質(zhì)粒。。。。大小10kb左右，用的天根質(zhì)粒大提試劑盒，腫么會(huì)成這樣呢。。。 另外平時(shí)跑膠的時(shí)候，Marker總是一坨一坨的，不像論文上的那種一個(gè)條帶一個(gè)條帶的，平時(shí)都是配置1%的膠，0.25g加入約30ml的1×TAE，微波爐高火1min，低火1min，為毛Marker還是這樣紙呢。。。。 求助各位啊�。。。�！ A4.png [ Last edited by 1949stone on 2013-7-9 at 15:08 ] |
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操作步驟 1. 取100 ml (根據(jù)培養(yǎng)菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200 ml) 過夜培養(yǎng)的菌液， 室溫10,000 rpm (~11,500×g )離心3 min收集細(xì)菌。 注意：菌液較多時(shí)，可多次離心并將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。 2. 盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請(qǐng)倒置干凈的吸水紙上。 3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入10 ml溶液P1(請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A)，使用移液 器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。 注意：請(qǐng)務(wù)必徹底混懸，如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏 低。 TIANRed試劑的加入對(duì)于后續(xù)PCR、酶切和測序都沒有影響。使用時(shí)按照TIANRed：溶 液P1=1:200進(jìn)行混合，徹底顛倒混勻，混勻后的溶液為澄清的紅色。將混勻后的溶液加 入到收集好的菌體中徹底混勻，由于菌體的存在，混勻后的溶液為渾濁的紅色。如果提 取質(zhì)粒后需要進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，不建議客戶在實(shí)驗(yàn)中加入TIANRed試劑。 4. 向離心管中加入10 ml溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，室溫放置5 min。 注意：溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗�，以免污染基因組DNA。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠， 如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。 如果使用了TIANRed，添加P2之后徹底混勻后，溶液的顏色為澄清的紫色。如果在紫 色中混雜有渾濁的紅色，則說明裂解不充分，繼續(xù)混勻直至溶液顏色完全變?yōu)槌吻宓淖?br /> 色。 5. 向離心管中加入10 ml溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色 分散絮狀沉淀。然后室溫放置10 min左右。10,000 rpm (~11,500×g )離心5-10 min，使 白色沉淀離至管底（可適當(dāng)增加離心時(shí)間），將全部溶液小心倒入過濾器CS1中（請(qǐng)避 免倒入大量沉淀而阻塞過濾器），慢慢推動(dòng)推柄過濾，濾液收集在干凈的50 ml的管中 （客戶自備）。 注意：加入溶液P4后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果離心后倒入過濾器CS1中的 溶液有白色沉淀也不會(huì)影響過濾。如果菌體過多（>100 ml），推薦延長離心時(shí)間至20- 30 min。 如果使用了TIANRed，添加溶液P4之徹底混勻后，溶液為澄清的黃色，如果在黃色中混 有紫色，則說明復(fù)性不充分，繼續(xù)混勻至溶液顏色完全變?yōu)槌吻宓狞S色。 6. 向?yàn)V液中加入0.35倍濾液體積的異丙醇和1/2倍異丙醇體積的5M NaCl，上下顛倒充分混 勻。 注意：若此處無沉淀出現(xiàn)為正�，F(xiàn)象。 7. 4℃ 10,000 rpm (~11,500×g )離心30 min，輕輕倒掉上清液，將其倒置在吸水紙上。 8. 向管中加入6 ml 70%乙醇充分漂洗沉淀，4℃ 10,000 rpm (~11,500×g )離心10 min，輕 輕倒掉上清液，將其倒置在吸水紙上。 9. 重復(fù)步驟8。 10. 將離心管敞口室溫放置10-20 min，使乙醇充分揮發(fā)后加入1-1.5 ml 洗脫緩沖液TB，充分 溶解沉淀。 注意：洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用ddH2O做洗脫液應(yīng)保證其pH值在 7.5-8.0范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量的多少主要是依據(jù)質(zhì)粒的 拷貝數(shù)以及實(shí)驗(yàn)所需要的濃度來確定。洗脫緩沖液體積不少于1 ml，體積過小影響回收 效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。 |
2樓2013-07-08 09:35:19
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