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飄洋2008木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
載體構(gòu)建問(wèn)題
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| 本人初次做分子生物學(xué)，想將一目的基因約500bp,構(gòu)建到PBI121載體上，計(jì)劃先將目標(biāo)片段加上酶切位點(diǎn)后連接到T載體上，再經(jīng)雙酶切后連到PBI121載體上，連到T載體后才發(fā)現(xiàn)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)有問(wèn)題，我設(shè)的酶切位點(diǎn)是XbaI/SacI，T載體上也有XbaI/SacI酶切位點(diǎn)，沒(méi)辦法完整切下目標(biāo)片段，現(xiàn)在我該怎么做？能不能講目標(biāo)片段膠回收后直接連到經(jīng)雙酶切后連到PBI121載體上？請(qǐng)哪位高手能指點(diǎn)迷津，本人將不勝感激！ |
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幽魂銀龍
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2樓2013-07-19 19:28:04
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飄洋2008
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cicelyzh
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| 既然設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)，直接把純化后PCR產(chǎn)物酶切連接到PBI121，沒(méi)必要通過(guò)T載體了。我覺(jué)得如果不是克隆大量PCR產(chǎn)物，用不用T載體無(wú)所謂。 |
5樓2013-07-20 05:28:48
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| 同意樓上的，不用連接在T載體上了，設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的上下游引物，要切記設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)在PBI121載體上的多克隆位點(diǎn)處，且只能有一個(gè)酶切位點(diǎn)，不會(huì)切斷原質(zhì)粒。直接連接在PBI121上就可以了，很容易的�。═載體不用設(shè)計(jì)啊，直接PCR之后做酶連就可以啦） |
6樓2013-07-20 10:09:22
飄洋2008
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tiny_C
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lifuzhu3838
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一般有兩種方法，第一就是樓主做的，引物加上酶切位點(diǎn)，Taq酶擴(kuò)增連T載體，酶切。還有就是蟲(chóng)友回復(fù)的，但是這里的引物還是有點(diǎn)不一樣的，想酶切PCR產(chǎn)物，最好加上保護(hù)堿基。 這一步酶切是否切開(kāi)你是檢測(cè)不了的，所以直到你最后轉(zhuǎn)化才能看出來(lái)，如果長(zhǎng)出菌落，你都不知道是哪里出的問(wèn)題。如果長(zhǎng)出菌落了，也很難說(shuō)。分子這東西比較微觀，每一步都驗(yàn)證對(duì)了，再往下做比較好。 不知道你的引物有沒(méi)有加保護(hù)堿基，如果沒(méi)有，最好重新設(shè)計(jì)引物吧 |
9樓2013-07-21 13:25:52
ctt1984
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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10樓2013-07-21 14:28:33
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