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飄洋2008木蟲 (著名寫手)
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[求助]
載體構(gòu)建問題
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| 本人初次做分子生物學，想將一目的基因約500bp,構(gòu)建到PBI121載體上，計劃先將目標片段加上酶切位點后連接到T載體上，再經(jīng)雙酶切后連到PBI121載體上，連到T載體后才發(fā)現(xiàn)酶切位點設(shè)計有問題，我設(shè)的酶切位點是XbaI/SacI，T載體上也有XbaI/SacI酶切位點，沒辦法完整切下目標片段，現(xiàn)在我該怎么做？能不能講目標片段膠回收后直接連到經(jīng)雙酶切后連到PBI121載體上？請哪位高手能指點迷津，本人將不勝感激！ |
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lifuzhu3838
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【答案】應(yīng)助回帖
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一般有兩種方法，第一就是樓主做的，引物加上酶切位點，Taq酶擴增連T載體，酶切。還有就是蟲友回復(fù)的，但是這里的引物還是有點不一樣的，想酶切PCR產(chǎn)物，最好加上保護堿基。 這一步酶切是否切開你是檢測不了的，所以直到你最后轉(zhuǎn)化才能看出來，如果長出菌落，你都不知道是哪里出的問題。如果長出菌落了，也很難說。分子這東西比較微觀，每一步都驗證對了，再往下做比較好。 不知道你的引物有沒有加保護堿基，如果沒有，最好重新設(shè)計引物吧 |
9樓2013-07-21 13:25:52
幽魂銀龍
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2樓2013-07-19 19:28:04
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3樓2013-07-19 19:29:35
飄洋2008
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4樓2013-07-19 22:15:56
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