duke188

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[求助] 梯度PCR退火溫度

上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)
Tm(1M Na+)：68.2
Tm(50mM Na+)：46.6
下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)
Tm(1M Na+)：66.2
Tm(50mM Na+)：44.6
順便問下大家，Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么區(qū)別啊?
我該選擇哪個Tm��？

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1樓 2013-07-21 21:38:26

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shangrila911

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duke188(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖應(yīng)助！ 2013-07-21 23:05:54

Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+) 括號里面的表示鹽濃度，鹽濃度越高，Tm越高，不過還是根據(jù)自己的實際PCR情況而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作參考...

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一切都會好的!

2樓2013-07-21 22:01:11

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duke188

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2樓: Originally posted by shangrila911 at 2013-07-21 22:01:11
Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+) 括號里面的表示鹽濃度，鹽濃度越高，Tm越高，不過還是根據(jù)自己的實際PCR情況而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作參考...

我是新手，由于要做梯度PCR摸退火溫度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的話，退火溫度是不是太低了

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3樓2013-07-21 22:20:52

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cicelyzh

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引用回帖:

3樓: Originally posted by duke188 at 2013-07-21 22:20:52
我是新手，由于要做梯度PCR摸退火溫度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的話，退火溫度是不是太低了...

一般PCR時的退火溫度很少選在50°C以下。從你的引物大概是20nt，GC含量在50%左右，退火溫度一般在55-60°C。你可以根據(jù)這個設(shè)計你的溫度梯度。

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4樓2013-07-22 04:27:58

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Sthunder

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵交流 2013-07-22 11:49:12

根據(jù)你的序列，感覺你正向引物3端GC含量有點高，不過應(yīng)該沒有多大關(guān)系，直接做個50， 48,46的TD pcr就沒問題！Good luck！

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5樓2013-07-22 05:31:19

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xz2001199802

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eurofins給出你的引物Tm分別為57.3和55.3，所以我建議你用52 - 55°。我通常都是這么整的，應(yīng)該沒問題的

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越學(xué)越無知

6樓2013-07-22 18:31:43

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hyc_charles

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-07-23 08:21:20

PCR退火溫度做梯度的話，一般采取從高于TM值10℃的溫度開始，比如你的TM值是55℃那么你從65℃開始做梯度。另外可以坐下touch down試試，每個循環(huán)降0.7℃或者1℃，一般可以得到目的條帶，我是這么做的，供你參考下

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不但要做一個優(yōu)秀的人，更要做一個無可取代的人…

7樓2013-07-22 18:37:31

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6樓: Originally posted by xz2001199802 at 2013-07-22 18:31:43
eurofins給出你的引物Tm分別為57.3和55.3，所以我建議你用52 - 55°。我通常都是這么整的，應(yīng)該沒問題的

謝謝！DNA合成說明書上給的那些Tm沒有用么

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8樓2013-07-22 22:41:20

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7樓: Originally posted by hyc_charles at 2013-07-22 18:37:31
PCR退火溫度做梯度的話，一般采取從高于TM值10℃的溫度開始，比如你的TM值是55℃那么你從65℃開始做梯度。另外可以坐下touch down試試，每個循環(huán)降0.7℃或者1℃，一般可以得到目的條帶，我是這么做的，供你參考下

謝謝！我們要摸出退火溫度做定量PCR

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9樓2013-07-22 22:43:08

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xz2001199802

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應(yīng)該有用，但是我之前我用的公司的合成引物沒有這個信息，所以我也不知道你這個對退火溫度的選擇有什么作用

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越學(xué)越無知

10樓2013-07-22 22:46:16

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