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duke188

新蟲(chóng) (初入文壇)

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[求助] 梯度PCR退火溫度

上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)
Tm(1M Na+)：68.2
Tm(50mM Na+)：46.6
下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)
Tm(1M Na+)：66.2
Tm(50mM Na+)：44.6
順便問(wèn)下大家，Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么區(qū)別啊?
我該選擇哪個(gè)Tm��？

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1樓 2013-07-21 21:38:26

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cicelyzh

鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)

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【答案】應(yīng)助回帖

★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-07-22 11:49:07

引用回帖:

3樓: Originally posted by duke188 at 2013-07-21 22:20:52
我是新手，由于要做梯度PCR摸退火溫度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的話，退火溫度是不是太低了...

一般PCR時(shí)的退火溫度很少選在50°C以下。從你的引物大概是20nt，GC含量在50%左右，退火溫度一般在55-60°C。你可以根據(jù)這個(gè)設(shè)計(jì)你的溫度梯度。

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4樓2013-07-22 04:27:58

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shangrila911

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duke188(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-07-21 23:05:54

Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+) 括號(hào)里面的表示鹽濃度，鹽濃度越高，Tm越高，不過(guò)還是根據(jù)自己的實(shí)際PCR情況而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作參考...

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一切都會(huì)好的!

2樓2013-07-21 22:01:11

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duke188

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引用回帖:

2樓: Originally posted by shangrila911 at 2013-07-21 22:01:11
Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+) 括號(hào)里面的表示鹽濃度，鹽濃度越高，Tm越高，不過(guò)還是根據(jù)自己的實(shí)際PCR情況而定，一般PCR常用Tm(50mM Na+)作參考...

我是新手，由于要做梯度PCR摸退火溫度，按照Tm(50mM Na+)--5℃的話，退火溫度是不是太低了

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3樓2013-07-21 22:20:52

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Sthunder

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-07-22 11:49:12

根據(jù)你的序列，感覺(jué)你正向引物3端GC含量有點(diǎn)高，不過(guò)應(yīng)該沒(méi)有多大關(guān)系，直接做個(gè)50， 48,46的TD pcr就沒(méi)問(wèn)題！Good luck！

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5樓2013-07-22 05:31:19

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