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...山雨新蟲 (初入文壇)
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[求助]
EMSA實(shí)驗(yàn)問題
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最近在做EMSA實(shí)驗(yàn)，請教一個(gè)問題：做這個(gè)實(shí)驗(yàn)跑非變性膠時(shí)為啥不用考慮蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)呢，無論是酸性蛋白還是堿性蛋白都是用pH8.3的緩沖液？ [ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:32 ] |
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...山雨
新蟲 (初入文壇)
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4樓2013-07-25 17:47:44
fuyuandj86
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只要你蛋白不沉淀就沒事吧. 我理解EMSA是看的DNA或者RNA,只要DNA或者RNA結(jié)合到蛋白上,整個(gè)復(fù)合體就會帶負(fù)電荷.因?yàn)镈NA或者RNA的磷酸基團(tuán)帶有大量負(fù)電荷,蛋白的酸性堿性比起來不算什么.而且在大部分EMSA里只能看到Free DNA和Bound DNA的條帶,所以不在乎只有蛋白的條帶會跑到哪里. |
2樓2013-07-24 22:28:21
beimi
木蟲 (著名寫手)
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First if you use the denature gel the protein and DNA will separate, so then all the samples are the same. so you do not know your protein bind to your DNA or not. second, it is not need to consider protein PI, because of shit you will know the binding of your protein to the DNA of interest. If you get the shit, that means your get the results, of course you should do some negative control. good luck! |
3樓2013-07-25 01:50:29
冰島硫化葉菌
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我有一個(gè)疑問就是，不僅是ESMA跑膠過程中的buffer是堿性，在DNA與蛋白孵育的過程中的binding buffer也是堿性的，那么在蛋白和DNA結(jié)合的這個(gè)過程中，蛋白質(zhì)如果是中性的或者是酸性的，那么就是帶負(fù)電，那么蛋白怎么與帶負(fù)電的DNA結(jié)合呢？因?yàn)槲业膶?shí)驗(yàn)中現(xiàn)在遇到這個(gè)問題，蛋白等電點(diǎn)是7.5,EMSA試驗(yàn)中檢測不到shift條帶，且存在很明顯的堵孔現(xiàn)象。但footfrinting實(shí)驗(yàn)是能檢測到有明確的結(jié)合位點(diǎn)的。 |
5樓2017-03-25 19:27:50
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