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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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kamiles_007

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[交流] 最近實(shí)驗(yàn)室T載體連接一直都假陽(yáng)性

最近一個(gè)月來(lái)，實(shí)驗(yàn)室?guī)讉€(gè)同學(xué)包括我在內(nèi)，所有做分子的都是T載體連接總是得不到自己想要的陽(yáng)性克隆，菌液PCR的電泳圖顯示，連接上的片段總是比我的目的片段要短，不知道是什么原因！

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請(qǐng)教一下，這是否為假陽(yáng)性克隆的問(wèn)題，如果是，該如何提高陽(yáng)性克隆效率？已經(jīng)有20人回復(fù)
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1樓 2013-08-22 00:00:52

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kamiles_007(金幣+1): 謝謝參與
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-09-30 22:25:52
gyesang: 回帖置頂 2013-09-30 22:25:54

1 建議提高目的片段的濃度或把減少buffer的用量加給目的片段（buffer的量是可以做小的調(diào)整的譬如減少0.5微升，目的片段加大0.5微升）
2 如果目的片段較大陰性的是很多把單菌落都挑了吧有一次我的目的片段是1100bp 我挑了50個(gè)才有兩個(gè)陽(yáng)性的
3 做兩個(gè)連接體系涂?jī)蓚€(gè)皿加大成功概率

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6樓2013-08-23 19:37:42

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charrymiao

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kamiles_007(金幣+1): 謝謝參與
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-22 17:15:11

首先，你先測(cè)一下你核酸膠回收的濃度，看濃度怎么樣，說(shuō)不定膠回收操作有問(wèn)題。然后，看看你的連接條件是不是有什么問(wèn)題。電泳跑的短我也發(fā)生過(guò)，但是最后測(cè)序沒(méi)什么問(wèn)題，最后大家說(shuō)那染料有問(wèn)題。你下次多跑會(huì)兒，把膠的濃度稍微降低看看。希望能幫到你！

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3樓2013-08-22 11:26:50

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yujitianqing

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kamiles_007(金幣+1): 謝謝參與

連接前膠回收過(guò)嗎？確保是純的DNA？

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2樓2013-08-22 08:51:55

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Da果凍

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kamiles_007(金幣+1): 謝謝參與
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-09-30 22:25:36

我們實(shí)驗(yàn)室以前也是碰到這樣的問(wèn)題，連接之前目的片段需要切膠回收，你得保證膠回收試劑盒的質(zhì)量，有較高的濃度連接T載體陽(yáng)性克隆才會(huì)多，而且摩爾比例要控制在目的片段:T載體=1:4左右，你再試試吧

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5樓2013-08-23 01:37:23

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雙子の殤

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可以試一下。。。http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=6254162&authorid=1216489

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7樓2013-08-24 13:50:10

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kamiles_007

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很感謝以上給位兄臺(tái)給出的寶貴建議，但是我的確一一調(diào)試過(guò)，結(jié)果還是杯具，暫時(shí)停做，正在購(gòu)買(mǎi)新型試劑盒中

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8樓2013-09-09 15:03:06

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panyuzhu

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-09-30 22:26:22

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9樓2013-09-09 15:19:47

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sk1981521

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有可能是你的克隆菌出現(xiàn)了耐藥性

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10樓2013-09-12 19:36:42

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wh672

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

送紅花一朵

同學(xué)你好，請(qǐng)問(wèn)你的問(wèn)題解決了嗎？我從9月份開(kāi)始也出現(xiàn)這種情況，測(cè)序結(jié)果顯示鏈接進(jìn)去的是其他載體或者大腸桿菌的片段，現(xiàn)在仍舊沒(méi)有解決，想問(wèn)一下你是什么原因，謝謝！

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11樓2019-11-19 08:36:26

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wh672

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我也遇到了同樣的問(wèn)題～

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12樓2019-12-07 21:42:44

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yingying15884樓

2013-08-22 20:53 回復(fù)

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