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piaoyunokok木蟲 (正式寫手)
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[交流]
釀酒酵母轉(zhuǎn)化 已有2人參與
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大家做酵母轉(zhuǎn)化時(shí)都是這樣做的嗎？ 制備感受態(tài)：挑取2-3mm大小單克隆到3ml YPDA 30° 250rpm 震蕩培養(yǎng)8-12h------->按1：10000比例轉(zhuǎn)接到50 ml YPDA 培養(yǎng)16-20h OD600=0.15-0.3-------->2500rpm 5min 常溫 離心， 用30 ml 無菌水洗一次----------->加入100 ml YPDA 震蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)，OD600=0.4-0.5 -------->將其中50ml 離心，用1.1*LiAC/TE 1.5 ml 重懸，高速離心，去上清，用600 ul 重懸成酵母感受態(tài) 轉(zhuǎn)化：擔(dān)體DNA煮5min 冰水浴 重復(fù)一次------>混合5 ul 擔(dān)體DNA 1ul 質(zhì)粒 加入500 um PEG/LIAC--------->30° 200rpm 半個(gè)小時(shí)------>加入20 ul DMSO---------->42° 熱休克 期間每隔5分鐘混勻一次------->加 YPDA plus 1ml 高速離心，去上清-------->1 ml 0.9% NACL重懸 完畢 1. 為什么我的菌株在第二次擴(kuò)培時(shí)搖了12個(gè)小時(shí)OD就達(dá)到1.3以上了？然后我就按照那個(gè)比例接的菌，例如：本應(yīng)該OD0.3接到100ml的，也就是一共OD30，所以我的菌如果是OD1.5的話，就接入20ml到100ML的培養(yǎng)基里面。然后就只搖了半個(gè)小時(shí)就到了OD0.4多了，然后就硬著頭皮做了。。。 2.另外，質(zhì)粒就只添加1微升嗎？還是擔(dān)體DNA和質(zhì)粒的比例是5:1就好？ 3.30度處理的時(shí)候是要搖床嗎？我看有的是水浴的，每10-15Min混勻一下，怎樣處理比較好呢？ 4.大家都用了YPDA嗎？就用普通的YPD不行嗎？會(huì)有什么不一樣的結(jié)果呢？ 5.涂板后都要等上3天菌落直徑到2-3mm嗎？我的長了一天半就有1mm多了，也可以挑到了，是不是還要再長長呢？ |
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