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bingdong05銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
over-lap PCR 定點(diǎn)突變 已有1人參與
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| 最近在做點(diǎn)突變，利用的是over-lap PCR法，有個(gè)問題請教各位蟲友哈：前兩次pcr產(chǎn)物回收后，第三輪pcr時(shí)該如何去做呢？退火溫度如何設(shè)定呢？是1）先不加上下游引物，讓前兩次pcr產(chǎn)物混合后，互為模板進(jìn)行pcr，幾個(gè)循環(huán)后再加入引物（若這樣的話，退火溫度如何設(shè)定呢，幾個(gè)循環(huán)后再加上下游引物，退火溫度還需重新設(shè)定嗎？），還是2）開始就將引物加進(jìn)去，進(jìn)行pcr（這樣退火溫度如何設(shè)定呢）？還望蟲友們不吝賜教哈！ |
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ctajack
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【答案】應(yīng)助回帖
| 據(jù) 丁香通（網(wǎng)址：https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm），“第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后進(jìn)行3－5個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶，這樣做的好處是可以得到特異的擴(kuò)增，缺點(diǎn)是麻煩。另外一種方法是將引物，雙模板，酶，dntp等所有的反應(yīng)成分均一起加入PCR管，進(jìn)行反應(yīng)， 好處是節(jié)省時(shí)間，不太麻煩�！� |
4樓2020-12-07 10:25:09
clcl88
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5樓2020-12-07 11:16:46
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