紫眸玉兒

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[求助] 連接老連不上，求指導(dǎo)

最近，本來(lái)挺簡(jiǎn)單的連接老出問(wèn)題，自己也試了很多次。
實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：將一個(gè)載體上啟動(dòng)子替換成另外的啟動(dòng)子，用的酶切位點(diǎn)是DraIII,擴(kuò)增所需啟動(dòng)子的引物上有該酶切位點(diǎn)，還加上保護(hù)堿基GGG,上游引物為5'GGGCACGGGGTGAGGGAACAAAAGCTGGGTAC3' ；下游為5'GGGCACTTTGTGAATCCATGCTAGAGTCCC3'，擴(kuò)增后酶切回收，再與相應(yīng)的載體連接；連接體系載體和產(chǎn)物的濃度都很高，之前也試過(guò)很多體系，都不行，求指導(dǎo)！

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1樓 2013-09-08 19:55:06

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lliu

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11樓2013-09-10 01:21:34

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mochenmi

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為什么我沒(méi)有看見(jiàn)酶切位點(diǎn)？還有你酶切后回收到片段了？

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2樓2013-09-08 21:47:57

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2樓: Originally posted by mochenmi at 2013-09-08 21:47:57
為什么我沒(méi)有看見(jiàn)酶切位點(diǎn)？還有你酶切后回收到片段了？

CACNNNGTG是酶切位點(diǎn)，回收片段為900bp

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3樓2013-09-08 22:05:24

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zhouking8758

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-09-09 15:10:14

建議先上T載體，再酶切克隆。
另外，可以多增加幾個(gè)保護(hù)堿基。

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4樓2013-09-08 23:24:38

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cicelyzh

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kx444555: 金幣+1, 鼓勵(lì)交流 2013-09-09 15:10:20

因?yàn)镈raIII切出2'突出的NNN粘性末端，你確定載體上的DraIII位點(diǎn)上的NNN也是GGG？不是的話，粘性末端不匹配，需要做成平末端后連接。

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5樓2013-09-09 00:01:12

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可能是保護(hù)堿基太少的問(wèn)題，先連接T載體或平端連接再酶切看看。

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為什么

6樓2013-09-09 09:48:07

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4樓: Originally posted by zhouking8758 at 2013-09-08 23:24:38
建議先上T載體，再酶切克隆。
另外，可以多增加幾個(gè)保護(hù)堿基。

謝謝

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7樓2013-09-09 14:15:32

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5樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-09 00:01:12
因?yàn)镈raIII切出2'突出的NNN粘性末端，你確定載體上的DraIII位點(diǎn)上的NNN也是GGG？不是的話，粘性末端不匹配，需要做成平末端后連接。

一個(gè)是GGG,另一端是TTT,所以引物設(shè)計(jì)用的也是這兩個(gè)位點(diǎn)

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8樓2013-09-09 14:16:52

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6樓: Originally posted by 547star at 2013-09-09 09:48:07
可能是保護(hù)堿基太少的問(wèn)題，先連接T載體或平端連接再酶切看看。

謝謝，我先試試吧！

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9樓2013-09-09 14:17:27

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冰風(fēng)顫木

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曾今也遇到該問(wèn)題，現(xiàn)在沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)了啊我的方法是：
（1）把片段先做T克隆然后測(cè)序如果正確再做鏈接；
（2）感受態(tài)制作很重要這個(gè)很重要一定要全程冰浴
你再試試吧應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題的

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船到橋頭自然直

10樓2013-09-09 18:00:21

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