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witake

銀蟲 (正式寫手)

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專業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)

[求助] 急求PCR 求實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) PCR

PCR
引物nearest neighbor 都在55度左右。做57、59連個(gè)梯度是有非特異條帶(BLAST過了，引物是很特異的），53 55 PCR得到的目的條帶很淡，而引物條帶挺亮。之前覺得是模板量少，但加大了量效果也沒什么變化。25ul的體系，Taq酶是按0.2+0.1步驟加。還有一個(gè)現(xiàn)象就是：當(dāng)我做50ul的體系有時(shí)沒有目的條帶，而25ul體系一般都有目的條帶。現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)不能往下做了，求各位指點(diǎn)迷津！

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1樓 2013-09-13 10:50:46

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hl16010921

木蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

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gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-09-13 22:23:28

1.試試降落PCR。強(qiáng)烈建議57 10個(gè)循環(huán)，55 30循環(huán)。 2.一般都是小體積的PCR效果不如大體積的，畢竟大體積的要準(zhǔn)確穩(wěn)定。但PCR儀和PCR管的導(dǎo)熱性不良的話小體積有利。3.taq最好是多個(gè)樣品預(yù)混好（一次幾個(gè)樣一起加1ul，然后分裝）4.53,55試試極少量DMSO，應(yīng)該能改善，一般不要超過2%。5,再不行，切帶，做二次PCR

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