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[求助]
求助解讀PCR圖為什么會(huì)這么爛
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之前做的都挺不錯(cuò)挺穩(wěn)定的 回了半個(gè)月的家 之后就做不出來了 所有的東西都換新的試了還是不行啊 ，，，，求大俠指點(diǎn)迷津 體系25ul buffer 2.5 Dntp 2 F 0.3 R 0.3 模板 0.5 酶 0.5 水補(bǔ)至25ul 求指點(diǎn)迷津 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 細(xì)胞培養(yǎng) |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主的PCR擴(kuò)增應(yīng)該是出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶的原因與對(duì)策 2013年8月23日總結(jié)（第二次修訂，加上序號(hào)，使文章的層次清晰，另外修正了錯(cuò)漏之處） PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。 其對(duì)策有： 1.減少酶量（一般以2單位Taq DNA聚合酶為基點(diǎn)，分梯度上下調(diào)一調(diào)，其他酶也差不多如此濃度，可以參考說明書）；加強(qiáng)DNA聚合酶的專一性或調(diào)換另一來源的專一性更好的DNA聚合酶。 2. 增加DNA聚合酶的專一性。 （1）改用專一性更強(qiáng)的DNA聚合酶，或者使用兩種不同的DNA聚合酶，減低酶量或調(diào)換另一來源的專一性高的酶。更換DNA聚合酶時(shí)，酶量不要太大，以免出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。 （2）酶制劑中的甘油可能也是干擾因素�？梢约尤敕磻�(yīng)體系之前用超濾去除酶制劑中的甘油，若此操作引起酶的濃度過高，可以適當(dāng)加雙蒸餾水稀釋。 （3）為了加強(qiáng)Taq DNA聚合酶的專一性。 的專一性，可在反應(yīng)體系中加入：1-1.5mol/L的甜菜堿或者5%的DMSO可以提高PCR擴(kuò)增效率，兩者可以增加Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定性。 3.適當(dāng)減少dNTP的濃度；減少dNTP的濃度一般需要與降低Mg2+濃度同方向偶聯(lián)進(jìn)行，但是不必按同樣的比例。 4.適當(dāng)降低Mg2+濃 度，可以采用梯度遞減方式，以每次0.5mol/L遞減，但是Mg2+的終濃度不要低于1.0mol/L。 5. 縮短PCR反應(yīng)的退火溫度時(shí)間或調(diào)高復(fù)性溫度。沒有重新設(shè)計(jì)引物之前，不要大范圍地變動(dòng)反應(yīng)體系的復(fù)性溫度，要在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)變動(dòng)。如果出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，則在引物的Tm少5-10度的范圍內(nèi)把PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度提高1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，非特異性擴(kuò)增較多，這時(shí)，最初的退火溫度選用比Tm高5-10度。然后每隔1個(gè)循環(huán)，退火溫度降低1-2度，直至到達(dá)正常的Tm附近的退火溫度。 7.采用使用專一性更強(qiáng)的梯度降低PCR、熱啟動(dòng)PCR和巢式PCR。使用熱啟動(dòng)模式。使用熱啟動(dòng)時(shí)可以購買商用的PCR熱啟動(dòng)酶，也可以用石蠟隔離模式。巢式PCR也有現(xiàn)成的試劑盒可以購買。 8. 保證PCR反應(yīng)的DNA模板的質(zhì)量，要用電泳檢測一下分子量和純度，質(zhì)量不好則要重新提取和純化DNA模板；適當(dāng)增加DNA模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 9.以上措施都不行時(shí)，最后就只能重新設(shè)計(jì)引物，加強(qiáng)引物的專一性。 |
10樓2013-09-19 12:40:49
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