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pingkaihe金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
費(fèi)簡(jiǎn)樹(shù)森
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[求助]
RT-PCR的關(guān)鍵
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| 剛開(kāi)始進(jìn)實(shí)驗(yàn)來(lái)做RT-PCR去P家蠶血細(xì)胞的兩個(gè)基因，鼓搗了一個(gè)月了，屢次失敗，想請(qǐng)大家交流一下自己做RT-PCR中遇到的問(wèn)題及如何解決的，互相學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步了。 |
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zgb1982
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
pingkaihe: 金幣+10, ★有幫助 2013-10-07 12:24:59
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-10-21 14:51:05
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| 你這個(gè)問(wèn)題太大了，每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。很多類似的帖子可以看看。我覺(jué)得主要就是RNA要完整性要好，反轉(zhuǎn)用�？煽康姆崔D(zhuǎn)酶，cDNA質(zhì)量要高，PCR過(guò)程就是體系優(yōu)化和引物設(shè)計(jì)，選擇好用的taq酶。沒(méi)了，不知道你基因能多長(zhǎng)。 |
2樓2013-10-07 11:35:36
pingkaihe
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3樓2013-10-07 12:24:37
zgb1982
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-10-29 18:35:02
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-10-29 18:35:02
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昆蟲(chóng)的我沒(méi)接觸過(guò)，我的主要是植物。我個(gè)人感覺(jué)2000+不是很好擴(kuò)，我第一次擴(kuò)的基因cDNA2080bp，很偶然的借用別人放了很久的cDNA居然一次就擴(kuò)出來(lái)了。也沒(méi)什么捷徑，多試幾次吧。如果RNA沒(méi)問(wèn)題，就看反轉(zhuǎn)的cDNA了，能擴(kuò)出來(lái)700bp畢竟較短，很好擴(kuò)。實(shí)在不行就按你說(shuō)的分段擴(kuò)吧，能擴(kuò)出來(lái)才是目的。 |
4樓2013-10-07 13:01:10
大鳥(niǎo)01
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pingkaihe(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-10-21 14:51:21
pingkaihe(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-10-21 14:51:21
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p不出來(lái)是很正常的事情，我們不凡逆推下：靶基因無(wú)擴(kuò)增條帶，可能由以下幾點(diǎn)因素決定1.引物設(shè)計(jì)是否合適，尤其是擴(kuò)增長(zhǎng)基因，是否考慮到了引物和靶基因之間的非特異性擴(kuò)增問(wèn)題，非特異性擴(kuò)增嚴(yán)重不嚴(yán)重。2.擴(kuò)增的酶是否失效，這種酶的類型你了解嗎（普通性、熱啟動(dòng)型及高保真型）3.PCR體系是MIX型還是需要自己優(yōu)化,用的是哪家公司的試劑盒，一般推薦用PROMEGA TAKARA QIGEN 天根;4.剛開(kāi)始做實(shí)驗(yàn)，細(xì)節(jié)非常重要，你注意到細(xì)節(jié)沒(méi)有。操作盡量在低溫下進(jìn)行！4.RT選用的試劑盒同3點(diǎn)所說(shuō)，同時(shí)是否注意到是一步法還是二步法（RT步驟），個(gè)人偏向二步法。5.所用的逆轉(zhuǎn)錄引物，真核生物的RNA結(jié)構(gòu)有POLA尾，但你要確認(rèn)下你的靶基因所在的全長(zhǎng)基因特點(diǎn)，是否也含POLA尾。6。逆轉(zhuǎn)錄可以選擇隨機(jī)引物或者是擴(kuò)增靶基因的上游引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物。7.RNA提取，你用的是什么方法，柱法、磁珠法還是trizol法各種方法效果不同，剛開(kāi)始做建議先用柱法，得到的核酸比較純。8.你所用的耗材是否注意到無(wú)核酸酶，并且操作細(xì)節(jié)上是否注意到無(wú)核酸酶的環(huán)境。 剛開(kāi)始做應(yīng)該注意下這些問(wèn)題，并有意識(shí)的看看細(xì)節(jié)，這樣的話可能對(duì)你今后的實(shí)驗(yàn)有幫助。呵呵，一點(diǎn)建議。 |
5樓2013-10-21 14:40:01
pingkaihe
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非常感謝你的提醒，也感覺(jué)細(xì)節(jié)很重要，目前還沒(méi)P出來(lái)，（1）引物無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，無(wú)二聚體，如果存在目的基因，非特異性擴(kuò)增應(yīng)該不會(huì)影響太多。（2）陽(yáng)性對(duì)照做出來(lái)了，擴(kuò)增體系應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題。（3）也是使用兩步法。（4）文獻(xiàn)中有報(bào)道做出來(lái)了，用oligodT做的反轉(zhuǎn)錄PCR。（5）現(xiàn)在還感覺(jué)是RNA的質(zhì)量問(wèn)題吧，主要是材料獲取困難，為家蠶的血細(xì)胞，而家蠶血細(xì)胞量很少。提取的RNA跑電泳存在28S條帶很弱，18S條帶很亮的問(wèn)題。 |
6樓2013-10-21 19:01:45
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