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pingkaihe金蟲 (正式寫手)
費(fèi)簡樹森
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[求助]
RT-PCR的關(guān)鍵
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| 剛開始進(jìn)實(shí)驗(yàn)來做RT-PCR去P家蠶血細(xì)胞的兩個(gè)基因，鼓搗了一個(gè)月了，屢次失敗，想請大家交流一下自己做RT-PCR中遇到的問題及如何解決的，互相學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步了。 |
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zgb1982
木蟲 (正式寫手)
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4樓2013-10-07 13:01:10
zgb1982
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-10-21 14:51:05
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-10-21 14:51:05
| 你這個(gè)問題太大了，每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)出現(xiàn)問題。很多類似的帖子可以看看。我覺得主要就是RNA要完整性要好，反轉(zhuǎn)用�？煽康姆崔D(zhuǎn)酶，cDNA質(zhì)量要高，PCR過程就是體系優(yōu)化和引物設(shè)計(jì)，選擇好用的taq酶。沒了，不知道你基因能多長。 |
2樓2013-10-07 11:35:36
大鳥01
銅蟲 (初入文壇)
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pingkaihe(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-10-21 14:51:21
pingkaihe(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-10-21 14:51:21
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p不出來是很正常的事情，我們不凡逆推下：靶基因無擴(kuò)增條帶，可能由以下幾點(diǎn)因素決定1.引物設(shè)計(jì)是否合適，尤其是擴(kuò)增長基因，是否考慮到了引物和靶基因之間的非特異性擴(kuò)增問題，非特異性擴(kuò)增嚴(yán)重不嚴(yán)重。2.擴(kuò)增的酶是否失效，這種酶的類型你了解嗎（普通性、熱啟動(dòng)型及高保真型）3.PCR體系是MIX型還是需要自己優(yōu)化,用的是哪家公司的試劑盒，一般推薦用PROMEGA TAKARA QIGEN 天根;4.剛開始做實(shí)驗(yàn)，細(xì)節(jié)非常重要，你注意到細(xì)節(jié)沒有。操作盡量在低溫下進(jìn)行！4.RT選用的試劑盒同3點(diǎn)所說，同時(shí)是否注意到是一步法還是二步法（RT步驟），個(gè)人偏向二步法。5.所用的逆轉(zhuǎn)錄引物，真核生物的RNA結(jié)構(gòu)有POLA尾，但你要確認(rèn)下你的靶基因所在的全長基因特點(diǎn)，是否也含POLA尾。6。逆轉(zhuǎn)錄可以選擇隨機(jī)引物或者是擴(kuò)增靶基因的上游引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物。7.RNA提取，你用的是什么方法，柱法、磁珠法還是trizol法各種方法效果不同，剛開始做建議先用柱法，得到的核酸比較純。8.你所用的耗材是否注意到無核酸酶，并且操作細(xì)節(jié)上是否注意到無核酸酶的環(huán)境。 剛開始做應(yīng)該注意下這些問題，并有意識(shí)的看看細(xì)節(jié)，這樣的話可能對你今后的實(shí)驗(yàn)有幫助。呵呵，一點(diǎn)建議。 |
5樓2013-10-21 14:40:01
pingkaihe
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非常感謝你的提醒，也感覺細(xì)節(jié)很重要，目前還沒P出來，（1）引物無發(fā)卡結(jié)構(gòu)，無二聚體，如果存在目的基因，非特異性擴(kuò)增應(yīng)該不會(huì)影響太多。（2）陽性對照做出來了，擴(kuò)增體系應(yīng)該沒問題。（3）也是使用兩步法。（4）文獻(xiàn)中有報(bào)道做出來了，用oligodT做的反轉(zhuǎn)錄PCR。（5）現(xiàn)在還感覺是RNA的質(zhì)量問題吧，主要是材料獲取困難，為家蠶的血細(xì)胞，而家蠶血細(xì)胞量很少。提取的RNA跑電泳存在28S條帶很弱，18S條帶很亮的問題。 |
6樓2013-10-21 19:01:45
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