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s24512453新蟲 (初入文壇)
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[求助]
有關(guān)T載體以及藍(lán)白篩選的3個(gè)問(wèn)題
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將目的片段與T載體連接，之后轉(zhuǎn)化，藍(lán)白篩選 1.長(zhǎng)出白斑，說(shuō)明T載體之間連上了片段，此片段就應(yīng)該是目的片段了，因?yàn)橹暗碾娪敬_定目的片段為單一條帶，割膠回收后再跑電泳也是單一條帶，但是后續(xù)的測(cè)序要么是片段大小不對(duì)，要么是空載。 2平板在4度放了一段時(shí)間拿出來(lái)確定菌落是白色，第二天再看還是白色，不可能是傳說(shuō)中的沒(méi)有變藍(lán)，難道空載的也會(huì)是藍(lán)色？那藍(lán)白篩選還有什么作用 3菌落pcr有正確條帶，對(duì)相應(yīng)的菌提取質(zhì)粒，送去測(cè)序后結(jié)果總是不對(duì)，這是為何？感受態(tài)轉(zhuǎn)化之后的涂布量應(yīng)該怎么控制，會(huì)不會(huì)是我涂布了過(guò)多的菌泥導(dǎo)致游離的質(zhì)粒都附著在了菌落上或者周圍，導(dǎo)致的結(jié)果就是挑取十個(gè)白斑，十個(gè)白斑pcr都正確，結(jié)果測(cè)序都不對(duì)，這種可能性應(yīng)該不大吧 |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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s24512453: 金幣+5 2013-10-13 08:22:02
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s24512453: 金幣+5 2013-10-13 08:22:02
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1. 白斑說(shuō)明有插入，是不是目的片段就不一定了，所以藍(lán)白斑只是初篩，需要進(jìn)一步鑒定。 2. 空載體是藍(lán)斑。 3. 菌落PCR會(huì)有假陽(yáng)性的可能。對(duì)陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒做酶切鑒定后再送測(cè)序。轉(zhuǎn)化涂布的量一般考經(jīng)驗(yàn)控制，新手可以多涂幾個(gè)不同量的板子。菌落PCR一般用的是載體上的引物，如果用片段特異性引物也是一個(gè)用片段特異引物，一個(gè)用載體上的引物。所以你說(shuō)的什么游離DNA影響PCR擴(kuò)增的假設(shè)基本不成立。而且你也對(duì)陽(yáng)性克隆提取了質(zhì)粒，應(yīng)該先做酶切鑒定，酶切圖譜正確后再測(cè)序。 |
4樓2013-10-13 01:40:09
yang0071
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2樓2013-10-12 15:31:28
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3樓2013-10-12 21:20:58
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5樓2013-10-13 08:24:20
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