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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 酶活求助�。。。。。�
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風吹我已散木蟲 (正式寫手)
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[求助]
酶活求助�。。。。。�
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各位，求救!!!!!!!!! 我是要測一個在大腸桿菌里面異源表達的一個蛋白的酶活，這個酶原則上來說，可以催化A和B生成C和D，反應是不可逆的。然后我就搖菌，IPTG誘導，超聲破碎（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）提蛋白，然后分光光度計測底物A的變化。變化是有了，可是負對照（不加IPTG誘導）也有變化啊（底物A的吸收值下降的程度和我加IPTG誘導后蛋白提取物的結果差不多）。然后我懷疑是不是我的這個轉化后的大腸桿菌可以表達微量的目的蛋白，這微量的蛋白足以催化我的反應？ 于是我把蛋白換成是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油），再加兩個底物A和B，結果，悲催了，分光光度計顯示的變化和之前的實驗結果一樣�。。。。。。。。�！ 酶活實驗步驟：1，空白對照（Tris+雙蒸水+蛋白粗提物+BSA), Measure Blank 2，Tris+雙蒸水+BSA+底物A, Measure Sample(底物A在A 300nm有最大吸收峰） 3， 加蛋白粗提物，Measure Sample 4，加底物B，Measure Sample（所有實驗在此時，A 300nm下降劇烈，吸收值約變?yōu)橹暗?/4）。不知道是什么原因，我原本想著可能是目的蛋白在大腸桿菌里面的微量表達也注意催化我的反應；可是不加蛋白，將試驗中加蛋白的步驟換成是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）， 分光光度計顯示的結果也基本一樣，到底是什么原因呢？是BSA的干擾么？還是？？？？？？ |
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 蛋白質生物學實驗經驗 |
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