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風(fēng)吹我已散木蟲(chóng) (正式寫手)
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[求助]
酶活求助�。。。。�！
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各位，求救!!!!!!!!! 我是要測(cè)一個(gè)在大腸桿菌里面異源表達(dá)的一個(gè)蛋白的酶活，這個(gè)酶原則上來(lái)說(shuō)，可以催化A和B生成C和D，反應(yīng)是不可逆的。然后我就搖菌，IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）提蛋白，然后分光光度計(jì)測(cè)底物A的變化。變化是有了，可是負(fù)對(duì)照（不加IPTG誘導(dǎo)）也有變化�。ǖ孜顰的吸收值下降的程度和我加IPTG誘導(dǎo)后蛋白提取物的結(jié)果差不多）。然后我懷疑是不是我的這個(gè)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌可以表達(dá)微量的目的蛋白，這微量的蛋白足以催化我的反應(yīng)？ 于是我把蛋白換成是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油），再加兩個(gè)底物A和B，結(jié)果，悲催了，分光光度計(jì)顯示的變化和之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣�。。。。。。。。�！ 酶活實(shí)驗(yàn)步驟：1，空白對(duì)照（Tris+雙蒸水+蛋白粗提物+BSA), Measure Blank 2，Tris+雙蒸水+BSA+底物A, Measure Sample(底物A在A 300nm有最大吸收峰） 3， 加蛋白粗提物，Measure Sample 4，加底物B，Measure Sample（所有實(shí)驗(yàn)在此時(shí)，A 300nm下降劇烈，吸收值約變?yōu)橹暗?/4）。不知道是什么原因，我原本想著可能是目的蛋白在大腸桿菌里面的微量表達(dá)也注意催化我的反應(yīng)；可是不加蛋白，將試驗(yàn)中加蛋白的步驟換成是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）， 分光光度計(jì)顯示的結(jié)果也基本一樣，到底是什么原因呢？是BSA的干擾么？還是？？？？？？ |
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4樓2013-10-19 09:47:31
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5樓2013-10-19 09:48:13
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6樓2013-10-19 13:39:32
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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我個(gè)人認(rèn)為可能原因如下： 1.可能是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折疊形態(tài)與酶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品不一樣。導(dǎo)致蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白至少在實(shí)驗(yàn)條件下并沒(méi)有催化反應(yīng)。 檢驗(yàn)此問(wèn)題可分別測(cè)定：蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的紅外吸收峰和紫外吸收峰、PBS緩沖液+10%甘油的紅外吸收峰和紫外吸收峰、BSA的紅外吸收峰和紫外吸收峰以及酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收峰和紫外吸收峰。 比較一下：蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的紅外傅里葉光譜是不是大致能夠用BSA的紅外吸收峰和酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收峰能加上PBS緩沖液+10%甘油的紅外吸收峰夠線性疊加而獲得。如果能夠獲得，則可能是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折疊形態(tài)與酶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品是一樣的可能性較大，但是不一定。可是如果蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的紅外傅里葉光譜不能大致能夠用BSA的紅外吸收峰和酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收峰能加上PBS緩沖液+10%甘油的紅外吸收峰夠線性疊加而獲得，那么可以肯定酶蛋白在提取液中的折疊狀態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)品不一樣。 如果以上的紅外光譜線性疊加實(shí)驗(yàn)是肯定的結(jié)果，那么就還需要測(cè)丁和對(duì)比紫外光譜實(shí)驗(yàn)。步驟如下： 把蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白用低溫低速攪拌前后分別測(cè)定紅外吸收峰和紫外吸收峰是否變化，如果明顯的變化，那可能BSA與酶蛋白發(fā)生了相互作用，反之則沒(méi)有相互作用。 要是有經(jīng)費(fèi)，當(dāng)然也可以用MALDI-MS測(cè)定蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白與BSA是否發(fā)生了相互作用，不過(guò)沒(méi)有必要，而且酶蛋白與BSA發(fā)生了相互作用MALDI-MS也不是每一次都能測(cè)定出來(lái)。 用Pull down也可以測(cè)定蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白與BSA是否發(fā)生了相互作用，不是也同樣沒(méi)有必要。用紅外和紫外已經(jīng)夠了，最后再測(cè)一下CD和熒光光譜。 2.蛋白提取液中的PBS緩沖液和10%甘油可能干擾了催化反應(yīng)，用超濾分別去除掉PBS緩沖液和10%甘油，看一下催化效果，即可判定。 3.蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）pH不適合催化反應(yīng)。把pH調(diào)到最師范反應(yīng)條件再試試。 4.底物濃度、酶濃度不適合。調(diào)整一下反應(yīng)體系中的底物濃度、酶濃度。 |
7樓2013-10-19 14:50:13
凌波麗
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