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風(fēng)吹我已散木蟲 (正式寫手)
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[求助]
酶活求助�。。。。�！
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各位，求救!!!!!!!!! 我是要測一個在大腸桿菌里面異源表達的一個蛋白的酶活，這個酶原則上來說，可以催化A和B生成C和D，反應(yīng)是不可逆的。然后我就搖菌，IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）提蛋白，然后分光光度計測底物A的變化。變化是有了，可是負(fù)對照（不加IPTG誘導(dǎo)）也有變化�。ǖ孜顰的吸收值下降的程度和我加IPTG誘導(dǎo)后蛋白提取物的結(jié)果差不多）。然后我懷疑是不是我的這個轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌可以表達微量的目的蛋白，這微量的蛋白足以催化我的反應(yīng)？ 于是我把蛋白換成是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油），再加兩個底物A和B，結(jié)果，悲催了，分光光度計顯示的變化和之前的實驗結(jié)果一樣�。。。。。。。。�！ 酶活實驗步驟：1，空白對照（Tris+雙蒸水+蛋白粗提物+BSA), Measure Blank 2，Tris+雙蒸水+BSA+底物A, Measure Sample(底物A在A 300nm有最大吸收峰） 3， 加蛋白粗提物，Measure Sample 4，加底物B，Measure Sample（所有實驗在此時，A 300nm下降劇烈，吸收值約變?yōu)橹暗?/4）。不知道是什么原因，我原本想著可能是目的蛋白在大腸桿菌里面的微量表達也注意催化我的反應(yīng)；可是不加蛋白，將試驗中加蛋白的步驟換成是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）， 分光光度計顯示的結(jié)果也基本一樣，到底是什么原因呢？是BSA的干擾么？還是？？？？？？ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+6, 鼓勵交流 2013-10-20 09:59:46
風(fēng)吹我已散: 金幣+5, ★有幫助 2013-10-20 10:19:52
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我個人認(rèn)為可能原因如下： 1.可能是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折疊形態(tài)與酶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品不一樣。導(dǎo)致蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白至少在實驗條件下并沒有催化反應(yīng)。 檢驗此問題可分別測定：蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的紅外吸收峰和紫外吸收峰、PBS緩沖液+10%甘油的紅外吸收峰和紫外吸收峰、BSA的紅外吸收峰和紫外吸收峰以及酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收峰和紫外吸收峰。 比較一下：蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的紅外傅里葉光譜是不是大致能夠用BSA的紅外吸收峰和酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收峰能加上PBS緩沖液+10%甘油的紅外吸收峰夠線性疊加而獲得。如果能夠獲得，則可能是蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白的折疊形態(tài)與酶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品是一樣的可能性較大，但是不一定�？墒侨绻鞍滋崛∫海≒BS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白溶液的紅外傅里葉光譜不能大致能夠用BSA的紅外吸收峰和酶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紅外吸收峰能加上PBS緩沖液+10%甘油的紅外吸收峰夠線性疊加而獲得，那么可以肯定酶蛋白在提取液中的折疊狀態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)品不一樣。 如果以上的紅外光譜線性疊加實驗是肯定的結(jié)果，那么就還需要測丁和對比紫外光譜實驗。步驟如下： 把蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白用低溫低速攪拌前后分別測定紅外吸收峰和紫外吸收峰是否變化，如果明顯的變化，那可能BSA與酶蛋白發(fā)生了相互作用，反之則沒有相互作用。 要是有經(jīng)費，當(dāng)然也可以用MALDI-MS測定蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白與BSA是否發(fā)生了相互作用，不過沒有必要，而且酶蛋白與BSA發(fā)生了相互作用MALDI-MS也不是每一次都能測定出來。 用Pull down也可以測定蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）中的酶蛋白與BSA是否發(fā)生了相互作用，不是也同樣沒有必要。用紅外和紫外已經(jīng)夠了，最后再測一下CD和熒光光譜。 2.蛋白提取液中的PBS緩沖液和10%甘油可能干擾了催化反應(yīng)，用超濾分別去除掉PBS緩沖液和10%甘油，看一下催化效果，即可判定。 3.蛋白提取液（PBS緩沖液+BSA+10%甘油）pH不適合催化反應(yīng)。把pH調(diào)到最師范反應(yīng)條件再試試。 4.底物濃度、酶濃度不適合。調(diào)整一下反應(yīng)體系中的底物濃度、酶濃度。 |
7樓2013-10-19 14:50:13
2樓2013-10-18 21:17:01
fuyuandj86
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3樓2013-10-18 22:34:06
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4樓2013-10-19 09:47:31
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