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wangxding新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
同時(shí)分離血小板和紅細(xì)胞
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本人最近在做關(guān)于血小板和紅細(xì)胞（灌胃給藥大鼠的血漿）可能結(jié)合成分的研究，所以需要同時(shí)分離血小板和紅細(xì)胞，由于完全是菜鳥(niǎo)，在查閱相關(guān)文獻(xiàn)時(shí)學(xué)習(xí)到可能可行的兩種方法，希望能獲得相對(duì)純的血小板和紅細(xì)胞。下面是我遇到的疑惑，請(qǐng)各位多多指教，謝謝！ 1、抗凝劑的選擇：有的書(shū)上說(shuō)肝素鈉對(duì)血小板聚集有影響，如果需要同時(shí)分離血小板和紅細(xì)胞的話，是不是最好選擇枸櫞酸鈉？請(qǐng)教各位最好使用哪種抗凝劑能保持兩者的活性。 2、分離方法猜想：a、差速離心：先將抗凝血用900rpm，室溫離心1omin，吸取上層PRP，再將PRP以室溫3000rpm離心10分鐘，使血小板沉淀，將血小板用pH6.5的含EDTA0.2mmol/L的無(wú)Ca2+的Trode液洗滌3次，用pH7.4的PBS懸浮。另外，取下層血漿，加入3倍PBS液，3000r/min冷凍離心 10min，，棄上清液，反復(fù)洗滌三次，得到紅細(xì)胞懸液，向紅細(xì)胞懸液中以 1:80 比例加入預(yù)冷的 5mmol/L PH7.4Tris-HCl 溶液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑對(duì)甲苯磺酰氟（PMSF），之后以 80Hz 20℃超聲 15min，放入 4℃溶血過(guò)夜，將所得紅細(xì)胞溶血液以 15000r/min 離心 10min,棄上清液，再加入 5mmol/L PH 7.4Tris-HCl 溶液以 15000r/min 離心 10min，反復(fù)洗滌3-5次，最后得到乳白色膜，將其1:1 懸浮在 PBS 溶液中。 b、用密度梯度離心：這部分只做了初步了解，還沒(méi)有具體方案，希望各位能給些建議。 3、由于實(shí)驗(yàn)需要檢測(cè)的是與血小板和紅細(xì)胞膜結(jié)合的物質(zhì)，會(huì)采用pH4的PBS洗脫血小板和紅細(xì)胞膜，這種做法是否能夠?qū)⒔Y(jié)合成分洗脫，是否可行？有沒(méi)有必要使紅細(xì)胞溶血后得到紅細(xì)胞膜懸液再洗脫？ 4、蛋白酶抑制劑對(duì)甲苯磺酰氟（PMSF）加入量應(yīng)該為多少？ 5、在洗滌紅細(xì)胞膜時(shí)有的用Tris-HCL液也有Hank's液，兩者哪個(gè)更好？ 6、在做相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)所需要的儀器有哪些？比如是用EP管離心還是其他什么管？ 7、剛開(kāi)始離心時(shí)不用冷凍離心是否會(huì)對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生影響？ 問(wèn)題有點(diǎn)多再次多謝大家！ |
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