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月亮先生

金蟲 (小有名氣)

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專業(yè): 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

[求助] 半定量RT-PCR求助

做半定量RT-PCR兩個(gè)多月了，基本天天都拿從小鼠組織制取單細(xì)胞懸浮液提取RNA逆轉(zhuǎn)錄，然后PCR。之前用整個(gè)組織，只要模板的濃度大那么內(nèi)參十多二十多個(gè)循環(huán)就能出現(xiàn)條帶，目的基因三十多個(gè)循環(huán)就能出現(xiàn)條帶。
昨天組會(huì)，老師說不能用整個(gè)組織來做，用組織來做半定量只是用來練手。要拿組織里邊某種細(xì)胞亞群來做半定量這樣才能得到更深入的結(jié)果。我們課題組可以用流式細(xì)胞分選儀從某組織單細(xì)胞懸浮液中分選出單一的細(xì)胞群，但是有的細(xì)胞群數(shù)量不多，分選一天也就可能得到80萬個(gè)細(xì)胞（一般課題組研三的同學(xué)一周只能用分選儀一天）。我想問各位前輩，有人用過比較少的樣品來提取過RNA嗎。以我這段時(shí)間的經(jīng)驗(yàn)，1.0-2.5X10^6個(gè)細(xì)胞的RNA在逆轉(zhuǎn)錄后只能得到20ul濃度為30-50ug/ml的cDNA（用的事天根的試劑盒）。用這樣濃度的cDNA做出來的循環(huán)數(shù)不用太高PCR產(chǎn)物就飽和了。如果只用8X10^5或者幾萬個(gè)細(xì)胞來做逆轉(zhuǎn)錄，我做半定量的循環(huán)數(shù)可能就要到四五十個(gè)循環(huán)才出現(xiàn)條帶了。循環(huán)數(shù)太大，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響嗎。找了一些文獻(xiàn)，中文的文獻(xiàn)有部分還會(huì)涉及做實(shí)驗(yàn)具體的循環(huán)數(shù)而外文的文獻(xiàn)直接把結(jié)果放上去的。求指導(dǎo)。

回復(fù)此樓

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1樓 2013-10-26 19:32:16

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

智能機(jī)器人

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