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任天青金蟲 (小有名氣)
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[求助]
凝膠層析蛋白洗不下來
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各位大神： 我而今算是遇到了最詭異的事了。我用的是Sephadex G-75，手工分多次裝柱（沒有裝柱器），肉眼看來柱子裝的比較均勻。之前用藍(lán)色葡聚糖跑了一下，能跑出來。但不論是我的蛋白樣品或者是BSA溶液，核酸蛋白檢測儀均檢測不到蛋白質(zhì)存在。 詳細(xì)情況是這樣的： 1）第一次裝柱，藍(lán)色葡聚糖ok，將我的蛋白液【注】與藍(lán)色葡聚糖混合后再次上樣，結(jié)果在幾乎和藍(lán)色葡聚糖出來的同時，檢測儀發(fā)現(xiàn)有大量蛋白正在洗出來了。但一個蛋白峰過后，再也沒有檢測到有任何蛋白洗出。 2）用緩沖液沖洗柱床過夜，次日，加入~1%床體積的BSA溶液，發(fā)現(xiàn)一個蛋白吸收峰都沒有了。 【注】：溶解目的蛋白液的緩沖液是柱緩沖液的5×形式，上樣前已經(jīng)10000g離心去除了上樣中的沉淀。柱是25× Φ2.5cm的，流速約1ml/min(恒壓)。 這個會的人應(yīng)該是很簡單的，但小弟這邊還是自己摸索，希望大家給予點(diǎn)指導(dǎo)。不勝感激 |
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我參考的是來自上海西寶生物的說明書（http://www.docin.com/p-25091200.html）。其他有提到“凝膠過濾的上樣量一般為5％的床體積，我們建議初次上樣量控制在1－2％的床體積”。 此外，在發(fā)完此貼后，我用兩根相同的柱子連接在一起做成一個簡易的裝柱器，一次性完成裝柱。用1ml的BSA測試，得到與帖子中提到的第一次的結(jié)論相同，即蛋白和藍(lán)色葡聚糖同時被洗出來。 |
8樓2013-11-02 00:14:51
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