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lwm713新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
定量PCR實(shí)驗(yàn)中關(guān)于標(biāo)曲和溶解曲線的問(wèn)題
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最近做定量，結(jié)果總是不太好，總之有三個(gè)大問(wèn)題：1、標(biāo)曲不太好（R2太低）；2、擴(kuò)增效率太高或太低；3、溶解曲線出現(xiàn)多個(gè)峰，而且前面的部分呈震蕩趨勢(shì)。 其中水也換過(guò)，引物也換過(guò)，就是結(jié)果不好，蛋都要碎了。。。。 標(biāo)曲不很好原以為是混的不均勻（原來(lái)只用手輕彈十幾下用槍混勻十幾下），后來(lái)標(biāo)曲稀釋的時(shí)候用漩渦振蕩器混勻，但結(jié)果還是不是很好（R2<0.98），而且擴(kuò)增效率明顯增大了很多。。。。 求大神指點(diǎn)迷津�。。� 標(biāo)曲.jpg 溶解曲線.jpg |
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 QPCR 問(wèn)題簡(jiǎn)答 |
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| 你的擴(kuò)增曲線怎么樣 都能達(dá)到平臺(tái)期么 建議調(diào)一下模板和引物的濃度 把標(biāo)曲的CT值調(diào)的提前一點(diǎn) 個(gè)人感覺(jué)到30了基本都不靠譜，對(duì)于擴(kuò)增效率高的問(wèn)題 如果現(xiàn)在用的是三步法可以改為二步法，擴(kuò)增效率會(huì)降下來(lái)，另外就是反應(yīng)條件的問(wèn)題了，你的溶解曲線這么亂，把擴(kuò)增產(chǎn)物跑電泳分析一下吧 |
2樓2013-11-01 11:20:38
cicelyzh
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| 熔解曲線很不平滑，我覺(jué)得你的擴(kuò)增有問(wèn)題。熔解曲線很少有這么多峰的，通常即使是有引物二聚體，通常也是主峰前面一個(gè)小峰。你的引物特異性怎么樣，是否是單一產(chǎn)物？如果熔解曲線峰不單一，通常說(shuō)明有非特異擴(kuò)增或者引物二聚體，相應(yīng)的擴(kuò)增效率會(huì)增大。 |
3樓2013-11-01 12:28:14
lwm713
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8樓2013-11-02 10:48:26
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9樓2013-11-02 10:49:29
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