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[求助] 相對熒光定量PCR

各位蟲友，麻煩大家?guī)臀铱匆幌�，我做的試試熒光定量PCR，其中溶解曲線都還可以，但是擴(kuò)增曲線為什么會出現(xiàn)那種情況呢？真的不是很明白，請大家指導(dǎo)一下。其中我做了60個(gè)循環(huán)，里面初始的cDNA含量是9ng。

擴(kuò)增曲線.jpg

溶解曲線.jpg

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1樓 2013-07-02 20:59:51

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cicelyzh

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做60個(gè)循環(huán)也太多了吧。我懷疑你擴(kuò)增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45個(gè)循環(huán)。CT的最佳范圍是15-30。你的熔解曲線好像也有問題。熔解溫度太低，一般產(chǎn)物峰的熔解溫度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚體。你擴(kuò)增的是用RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA嗎？

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2樓2013-07-03 00:21:23

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 00:21:23
做60個(gè)循環(huán)也太多了吧。我懷疑你擴(kuò)增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45個(gè)循環(huán)。CT的最佳范圍是15-30。你的熔解曲線好像也有問題。熔解溫度太低，一般產(chǎn)物峰的熔解溫度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚 ...

我用的是RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA。這個(gè)不是引物二聚體，因?yàn)榕芡闝PCR后我又拿這個(gè)產(chǎn)物跑了電泳，結(jié)果條帶很亮，不是引物二聚體。

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3樓2013-07-03 08:48:09

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你應(yīng)該是做了兩組檢測，一組擴(kuò)增曲線看上去效果還是可以的，但是CT值最多跑45循環(huán)，后面的一般是非特異性擴(kuò)增很多，沒有意義的
另外一組檢測應(yīng)該是你的引物探針沒有設(shè)計(jì)好，出來的曲線亂七八糟。
現(xiàn)在有一步法的熒光PCR檢測，不用兩步這么麻煩，而且效果也好

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怪獸

4樓2013-07-03 08:56:56

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在PCR過程中，�？梢姷窖h(huán)次數(shù)到底應(yīng)為多少的問題。簡單計(jì)算就明白了。30循環(huán)，產(chǎn)物擴(kuò)增量為2^30，近似為10^9，如果用1000個(gè)模板分子，則PCR后，總量為 1000*10^9=10^12, 其摩爾數(shù)=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12)=1pmol
如果你的片段為200nt, 則PCR后的產(chǎn)物量=分子量*摩爾數(shù)=200*660*1.6*10^(-12)g=0.2*10^(-6)g=0.2ug
由此，可以看到正常PCR的擴(kuò)增效率。

另：
PCR是，你的引物總量是？ 40個(gè)循環(huán)、50個(gè)循環(huán)、60個(gè)循環(huán)需要消耗多少引物？我就不細(xì)算了。

因此請各位做PCR時(shí)，最好計(jì)算一下

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皇帝誕生地

5樓2013-07-03 09:28:48

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4樓: Originally posted by vicky8685 at 2013-07-03 08:56:56
你應(yīng)該是做了兩組檢測，一組擴(kuò)增曲線看上去效果還是可以的，但是CT值最多跑45循環(huán)，后面的一般是非特異性擴(kuò)增很多，沒有意義的
另外一組檢測應(yīng)該是你的引物探針沒有設(shè)計(jì)好，出來的曲線亂七八糟。
現(xiàn)在有一步法的熒 ...

是的，我是做了兩組，好的那一組是我的內(nèi)參，做的還比較好，另外那個(gè)歪歪曲曲的是我的目的基因，做之前我也用普通PCR做了一下，目的條帶也很亮，所以就拿來做QPCR了�？赡苁且锏膯栴}吧。

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6樓2013-07-03 10:04:25

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5樓: Originally posted by 透明的玻璃杯 at 2013-07-03 09:28:48
在PCR過程中，常可見到循環(huán)次數(shù)到底應(yīng)為多少的問題。簡單計(jì)算就明白了。30循環(huán)，產(chǎn)物擴(kuò)增量為2^30，近似為10^9，如果用1000個(gè)模板分子，則PCR后，總量為 1000*10^9=10^12, 其摩爾數(shù)=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12) ...

謝謝你詳細(xì)的回答，在做之前我確實(shí)沒有考慮這么多，剛開始只做了40個(gè)循環(huán)，但是擴(kuò)增曲線還沒有到達(dá)平穩(wěn)期，所以我就直接加到60個(gè)循環(huán)了，確實(shí)沒有仔細(xì)的算過。

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7樓2013-07-03 10:06:25

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5樓說的對。循環(huán)數(shù)與你的引物用量，dNTP用量都是相關(guān)的。
擴(kuò)增曲線不好的，都是模板濃度很低的吧。
另外，溶解曲線的起始溫度可以低一點(diǎn)，比方說從你的退火溫度開始（你不會采用的是兩步PCR，退貨溫度直接和延伸溫度相同吧？）

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8樓2013-07-03 10:24:46

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3樓: Originally posted by crazymouse66 at 2013-07-03 08:48:09
我用的是RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA。這個(gè)不是引物二聚體，因?yàn)榕芡闝PCR后我又拿這個(gè)產(chǎn)物跑了電泳，結(jié)果條帶很亮，不是引物二聚體。...

如果你確定是目標(biāo)產(chǎn)物的話當(dāng)然不錯(cuò)。不過，從擴(kuò)增曲線上看，有些不是標(biāo)準(zhǔn)的S型，可能是基因的豐度低，需要增加模板的使用量。順便問一下，你的cDNA濃度是怎樣定的？

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9樓2013-07-03 23:15:31

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7樓: Originally posted by crazymouse66 at 2013-07-03 10:06:25
謝謝你詳細(xì)的回答，在做之前我確實(shí)沒有考慮這么多，剛開始只做了40個(gè)循環(huán)，但是擴(kuò)增曲線還沒有到達(dá)平穩(wěn)期，所以我就直接加到60個(gè)循環(huán)了，確實(shí)沒有仔細(xì)的算過。...

40個(gè)循環(huán)都還沒到平臺期應(yīng)該先考慮增加模板

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10樓2013-07-03 23:25:22

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