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crazymouse66金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
相對(duì)熒光定量PCR
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各位蟲(chóng)友，麻煩大家?guī)臀铱匆幌�，我做的試試熒光定量PCR，其中溶解曲線都還可以，但是擴(kuò)增曲線為什么會(huì)出現(xiàn)那種情況呢？真的不是很明白，請(qǐng)大家指導(dǎo)一下。其中我做了60個(gè)循環(huán)，里面初始的cDNA含量是9ng。 擴(kuò)增曲線.jpg 溶解曲線.jpg |
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cicelyzh
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| 做60個(gè)循環(huán)也太多了吧。我懷疑你擴(kuò)增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45個(gè)循環(huán)。CT的最佳范圍是15-30。你的熔解曲線好像也有問(wèn)題。熔解溫度太低，一般產(chǎn)物峰的熔解溫度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚體。你擴(kuò)增的是用RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA嗎？ |
2樓2013-07-03 00:21:23
crazymouse66
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3樓2013-07-03 08:48:09
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你應(yīng)該是做了兩組檢測(cè)，一組擴(kuò)增曲線看上去效果還是可以的，但是CT值最多跑45循環(huán)，后面的一般是非特異性擴(kuò)增很多，沒(méi)有意義的 另外一組檢測(cè)應(yīng)該是你的引物探針沒(méi)有設(shè)計(jì)好，出來(lái)的曲線亂七八糟。 現(xiàn)在有一步法的熒光PCR檢測(cè)，不用兩步這么麻煩，而且效果也好 |
4樓2013-07-03 08:56:56
【答案】應(yīng)助回帖
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在PCR過(guò)程中，常可見(jiàn)到循環(huán)次數(shù)到底應(yīng)為多少的問(wèn)題。簡(jiǎn)單計(jì)算就明白了。30循環(huán)，產(chǎn)物擴(kuò)增量為2^30，近似為10^9， 如果用1000個(gè)模板分子，則PCR后，總量為 1000*10^9=10^12, 其摩爾數(shù)=10^12/6.02*10^23=1.6*10^(-12)=1pmol 如果你的片段為200nt, 則PCR后的產(chǎn)物量=分子量*摩爾數(shù)=200*660*1.6*10^(-12)g=0.2*10^(-6)g=0.2ug 由此，可以看到正常PCR的擴(kuò)增效率。 另： PCR是，你的引物總量是？ 40個(gè)循環(huán)、50個(gè)循環(huán)、60個(gè)循環(huán)需要消耗多少引物？ 我就不細(xì)算了。 因此請(qǐng)各位做PCR時(shí)，最好計(jì)算一下 |
5樓2013-07-03 09:28:48
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