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crazymouse66金蟲 (正式寫手)
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[求助]
相對熒光定量PCR
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各位蟲友，麻煩大家?guī)臀铱匆幌�，我做的試試熒光定量PCR，其中溶解曲線都還可以，但是擴(kuò)增曲線為什么會出現(xiàn)那種情況呢？真的不是很明白，請大家指導(dǎo)一下。其中我做了60個循環(huán)，里面初始的cDNA含量是9ng。 擴(kuò)增曲線.jpg 溶解曲線.jpg |
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crazymouse66
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7樓2013-07-03 10:06:25
cicelyzh
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| 做60個循環(huán)也太多了吧。我懷疑你擴(kuò)增的是什么。一般定量PCR的程序跑40或者45個循環(huán)。CT的最佳范圍是15-30。你的熔解曲線好像也有問題。熔解溫度太低，一般產(chǎn)物峰的熔解溫度在80°C以上，七十多度的一般都是引物二聚體。你擴(kuò)增的是用RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA嗎？ |
2樓2013-07-03 00:21:23
crazymouse66
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3樓2013-07-03 08:48:09
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你應(yīng)該是做了兩組檢測，一組擴(kuò)增曲線看上去效果還是可以的，但是CT值最多跑45循環(huán)，后面的一般是非特異性擴(kuò)增很多，沒有意義的 另外一組檢測應(yīng)該是你的引物探針沒有設(shè)計(jì)好，出來的曲線亂七八糟。 現(xiàn)在有一步法的熒光PCR檢測，不用兩步這么麻煩，而且效果也好 |
4樓2013-07-03 08:56:56
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