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wenxiaowu木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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western顯影時(shí)出現(xiàn)這種狀況，請(qǐng)問(wèn)是抗體的哪里出現(xiàn)問(wèn)題了？
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我用Native-PAGE跑的胰島素，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅可以染出條帶，但用博奧森的胰島素抗體rabbit anti-insulin和goat anti-rabbit lgG/HRP（TBST稀釋的）4度過(guò)夜孵育后，加ECL用凝膠成像儀曝光卻不顯影，是怎么回事？用暗盒時(shí)就更糟糕，膠片放到顯影液中黑黑的一片，什么都沒(méi)有 2013-10-02_11-45-26_8bit.png |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+5, 大神！ 2013-11-06 13:05:28
wenxiaowu: 金幣+20, ★有幫助 2013-11-07 11:57:22
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樓主說(shuō)的如果是轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到膜上的效率低，那么可以有如下解決方法（濕轉(zhuǎn)）： 1.轉(zhuǎn)移緩沖溶液中加入終濃度為20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但是增加蛋白質(zhì)與NC膜的結(jié)合能力；甲醇可以防止凝膠變形；甲醇對(duì)于高分子蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間。 2.轉(zhuǎn)移緩沖溶液中加入終濃度為0.1%的SDS。轉(zhuǎn)膜實(shí)際上就是讓蛋白質(zhì)進(jìn)入硝纖膜的纖維分子之間的空隙，所以蛋白質(zhì)變成線(xiàn)狀比較容易滲入到硝纖膜的纖維分子之間，因?yàn)榭臻g位阻小，且不容易在掉下來(lái)，所以在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入矢量濃度的SDS（可配置為：終濃度為0.1%這個(gè)濃度不可讓蛋白質(zhì)完全變?yōu)榫�(xiàn)狀，不然會(huì)影響后面的免疫識(shí)別）使得蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象變?yōu)榫�(xiàn)形比較容易操作成功。熱變性的蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象不是完全線(xiàn)形的，其中還存在很多的二級(jí)結(jié)構(gòu)，盡管并非天然二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是仍然對(duì)于蛋白質(zhì)進(jìn)入硝纖膜的纖維分子之間的空隙會(huì)構(gòu)成位阻效應(yīng)，在大分子量的蛋白質(zhì)中的熱變性的非天然二級(jí)結(jié)構(gòu)更多，所以位阻效應(yīng)在轉(zhuǎn)膜時(shí)更加明顯。至于免疫反應(yīng)那一步，抗體識(shí)別抗原的免疫決定簇有空間免疫決定簇也有序列免疫決定簇，一般只要不是蛋白質(zhì)完全變?yōu)榫�(xiàn)形且無(wú)序列免疫決定簇，就不會(huì)沒(méi)有免疫識(shí)別的現(xiàn)象出現(xiàn)。 3.使用小孔徑的NC膜，孔徑0.2um的膜。 4.使用戊二醛交聯(lián)蛋白質(zhì)。上樣后可以用戊二醛交聯(lián)膜上的蛋白質(zhì)，這樣蛋白質(zhì)自身構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)與NC膜的纖維網(wǎng)絡(luò)會(huì)彼此交叉構(gòu)成約束，使得NC膜上的蛋白質(zhì)不易被洗下來(lái)。 5.對(duì)于大分子量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓要高一點(diǎn)，一般 恒壓100V，限流400mA，時(shí)間也要延長(zhǎng)一點(diǎn)，比3小時(shí)要長(zhǎng)，開(kāi)始最好也用兩塊膜，注意加強(qiáng)降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。 6.適當(dāng)增加轉(zhuǎn)膜時(shí)間。 對(duì)于大分子量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓要高一點(diǎn)，一般 恒壓100V，限流400mA，時(shí)間也要延長(zhǎng)一點(diǎn)，比3小時(shí)要長(zhǎng)，注意加強(qiáng)降溫措施，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。 |
2樓2013-11-06 12:25:40
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5樓2013-11-07 17:13:04
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wenxiaowu: 金幣+15, ★★★很有幫助 2013-11-08 10:46:19
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配制一抗，加入BSA，脫脂奶粉就是起到一個(gè)封閉非特異性位點(diǎn)的作用。二抗有可能在用的過(guò)程中，被實(shí)驗(yàn)中所用的耗材等污染。你說(shuō)的這種現(xiàn)象我也遇到過(guò)，就是把每個(gè)步驟，都重新認(rèn)真改正，就沒(méi)問(wèn)題了，祝好運(yùn) |
6樓2013-11-07 18:40:26
wenxiaowu
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