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[求助]
有沒有什么好方法來(lái)挑選陽(yáng)性克隆
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最近一直在用gate way來(lái)重組pDONR質(zhì)粒，兩個(gè)目的片段，1個(gè)用的DNA模板是基因組基因，長(zhǎng)6Kb左右，另一個(gè)是cDNA模板，長(zhǎng)2Kb。 做了有半個(gè)月了，原先以為肯定是短的cDNA先做出來(lái)，沒想到現(xiàn)在大的做出來(lái)了，2kb的片段卻怎么也找不到陽(yáng)性克隆。 cDNA模板濃度似乎不高，pcr產(chǎn)物在割膠回收后濃度一般為70-100ng/ul。BP反應(yīng)后轉(zhuǎn)化DHa5后板子上能長(zhǎng)出20多個(gè)菌落，因?yàn)榫銹CR所有的菌落條帶都是一樣的，很多條帶，其中一條比較亮，我就以為都是陽(yáng)性，第二天提取質(zhì)粒電泳比對(duì)大小后卻發(fā)現(xiàn)都沒插進(jìn)去。 于是，又重新PCR，重新割膠回收，努力提高濃度，昨天轉(zhuǎn)化完，37度培養(yǎng)了約16小時(shí)，今天來(lái)一看發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)出了好多菌落。大概能有上百個(gè)了，有大有小。打算下午一會(huì)兒硬著頭皮再做次菌落PCR吧，可隱隱覺得結(jié)果會(huì)跟上次一樣，做了也沒辦法分辨陽(yáng)性克隆。 所以，各位高手能不能教教我怎么用肉眼分辨菌落呢？那些星星點(diǎn)點(diǎn)的菌落是不是就可以直接忽略了？一般成功率高的轉(zhuǎn)化大概長(zhǎng)幾個(gè)菌落比較靠譜？菌落是不是長(zhǎng)的越多越好？PS，我之前克隆6kb的目的片段成功的板子上一次只長(zhǎng)了1個(gè)菌落，一次長(zhǎng)了3個(gè)菌落。所以我現(xiàn)在看到越多菌落的板子心情立馬不好了。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
珉珉的小辮: 金幣+10, ★有幫助 2013-11-15 15:39:33
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-15 16:22:54
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-15 16:22:54
| 你質(zhì)粒上有抗性嗎，菌落pcr可信度不是很大，最好找一株比較好的，比如提質(zhì)粒帶清晰的，雙酶切驗(yàn)證下，實(shí)在切不出來(lái)，那就直接測(cè)序，以前我們實(shí)驗(yàn)室遇見過(guò)雙酶切切不動(dòng)，而測(cè)序后是正確的。 |
2樓2013-11-15 15:12:38
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-11-15 16:10:49
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-11-15 16:10:49
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謝謝回復(fù)。我的質(zhì)粒上有抗性，可是還是很多假陽(yáng)性。如果板子上菌落少，我一般都是直接提質(zhì)粒，比對(duì)大小。如果大小對(duì)上了之后再測(cè)序驗(yàn)證。 可是這幾次板子上菌落太多，我又一直不信菌落PCR結(jié)果，就想問問有沒有啥比菌落PCR更靠譜的方法。問了同實(shí)驗(yàn)室的人，也沒什么建議，大家似乎都是這樣做下來(lái)的。 無(wú)論如何，還是先做一次PCR吧，這次加入了兩個(gè)提出來(lái)的質(zhì)粒大小對(duì)上的菌落做陽(yáng)性對(duì)照，看看結(jié)果再說(shuō)吧。 |
3樓2013-11-15 15:43:17
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
縮++影: 屏蔽內(nèi)容, 反饋回復(fù)內(nèi)容有誤，屏蔽。 2013-11-16 00:25:26
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4樓2013-11-15 23:15:34
【答案】應(yīng)助回帖
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珉珉的小辮: 金幣+35, ★★★★★最佳答案 2013-11-18 14:36:27
珉珉的小辮: 金幣+35, ★★★★★最佳答案 2013-11-18 14:36:27
| 不好意思前面的回復(fù)是我搞錯(cuò)了，兩種pDONR是一樣的，因?yàn)橹亟M區(qū)大小是2000bp多點(diǎn)，所以你的序列重組到載體上后，質(zhì)粒的大小從電泳結(jié)果上看應(yīng)該與pDONR基本一致，用菌落質(zhì)�？焖傩√岱ǔ醪綑z測(cè)后，檢測(cè)出來(lái)大小與原質(zhì)粒一致的再做菌落PCR。 |
5樓2013-11-15 23:39:41
6樓2014-08-24 11:38:04
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