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有沒有什么好方法來挑選陽性克隆
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最近一直在用gate way來重組pDONR質(zhì)粒，兩個目的片段，1個用的DNA模板是基因組基因，長6Kb左右，另一個是cDNA模板，長2Kb。 做了有半個月了，原先以為肯定是短的cDNA先做出來，沒想到現(xiàn)在大的做出來了，2kb的片段卻怎么也找不到陽性克隆。 cDNA模板濃度似乎不高，pcr產(chǎn)物在割膠回收后濃度一般為70-100ng/ul。BP反應(yīng)后轉(zhuǎn)化DHa5后板子上能長出20多個菌落，因為菌落PCR所有的菌落條帶都是一樣的，很多條帶，其中一條比較亮，我就以為都是陽性，第二天提取質(zhì)粒電泳比對大小后卻發(fā)現(xiàn)都沒插進去。 于是，又重新PCR，重新割膠回收，努力提高濃度，昨天轉(zhuǎn)化完，37度培養(yǎng)了約16小時，今天來一看發(fā)現(xiàn)長出了好多菌落。大概能有上百個了，有大有小。打算下午一會兒硬著頭皮再做次菌落PCR吧，可隱隱覺得結(jié)果會跟上次一樣，做了也沒辦法分辨陽性克隆。 所以，各位高手能不能教教我怎么用肉眼分辨菌落呢？那些星星點點的菌落是不是就可以直接忽略了？一般成功率高的轉(zhuǎn)化大概長幾個菌落比較靠譜？菌落是不是長的越多越好？PS，我之前克隆6kb的目的片段成功的板子上一次只長了1個菌落，一次長了3個菌落。所以我現(xiàn)在看到越多菌落的板子心情立馬不好了。 |
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3樓2013-11-15 15:43:17
2樓2013-11-15 15:12:38
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
縮++影: 屏蔽內(nèi)容, 反饋回復(fù)內(nèi)容有誤，屏蔽。 2013-11-16 00:25:26
縮++影: 屏蔽內(nèi)容, 反饋回復(fù)內(nèi)容有誤，屏蔽。 2013-11-16 00:25:26
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4樓2013-11-15 23:15:34
5樓2013-11-15 23:39:41
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