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24K_純虹鐵蟲 (初入文壇)
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[交流]
有關(guān)重疊PCR的問題，請(qǐng)各位講解一下 已有5人參與
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| 大家好，我現(xiàn)在在做一個(gè)重疊PCR的實(shí)驗(yàn)，我要連接的三個(gè)片段X、Cm（氯霉素片段）、Y均750bp，我先通過正常的PCR技術(shù)獲得X、Cm（氯霉素片段）、Y條帶，然后嘗試先重疊X、Cm，得到XC之后再連Y的時(shí)候怎么也連不上，請(qǐng)問為什么？我是新手，請(qǐng)指點(diǎn)一下有關(guān)重疊PCR當(dāng)中需要注意的地方，謝謝！ |
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sun_in_night
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gyesang
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3樓2013-11-23 01:21:00
Fleaves
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24K_純虹
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lingbi
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我也是正要做重疊PCR，做第一步搭接反應(yīng)，在網(wǎng)上查到一些方案（12個(gè)引物片段），說每條引物加1ul，PCR65℃ 5cycle，60℃ 5cycle。而我在小木蟲上下了一篇文章PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences，引物的量加的極少，F(xiàn)01、R01各1ul,中間的引物（10條，引物濃度30pmol）各取1ul混合，混合后取0.5ul與F01、R01混在一起作為引物,PCR 58℃ 27cycle，還72℃延伸10min 。這兩個(gè)方法完全沒有相關(guān)性。 版主能夠給一個(gè)推薦反應(yīng)條件嗎？ 另外想問，引物加多少合適?英文的文獻(xiàn)引物的濃度會(huì)不會(huì)太低？ 退貨溫度根據(jù)什么定的？60℃左右會(huì)不會(huì)特異性太強(qiáng)P不出東西？ 望指點(diǎn)。 |
7樓2014-01-08 23:41:53
gyesang
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8樓2014-01-09 11:21:02
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9樓2014-01-09 22:55:31
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