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kongzhen1985

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[交流] 關(guān)于雙酶切的酶的失活問(wèn)題已有4人參與

最近實(shí)驗(yàn)要用到EcoRI和KpnI進(jìn)行雙酶切，且酶切以后需要進(jìn)行后續(xù)的連接反應(yīng)，EcoRI可以采用熱失活滅活，但是KpnI在網(wǎng)上搜索發(fā)現(xiàn)不能熱失活，想問(wèn)下有做過(guò)這方面的能幫分析下嗎？謝謝啦!!還有這兩個(gè)酶進(jìn)行雙酶切過(guò)夜可以嗎？

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1樓 2013-12-23 22:42:03

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luwei13566

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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-12-24 08:24:15

雙酶切后可以跑膠后割膠回收的方法進(jìn)行純化，回收后所有的酶全部除去~~，如果想過(guò)夜雙酶切首先要看看兩個(gè)酶的說(shuō)明書(shū)確定兩個(gè)酶的酶切buffer是否兼容，用不太兼容的buffer長(zhǎng)時(shí)間酶切可能會(huì)誘發(fā)star活性~~，

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3樓2013-12-24 00:30:13

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cicelyzh

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-12-24 00:22:41

通常做完酶切最好回收純化后再做連接。KpnI可以通過(guò)純化回收步驟失活。雖然各個(gè)公司的酶稍有不同，公司的說(shuō)明書(shū)上會(huì)有這方面的信息。據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，這兩個(gè)酶通常是可以切過(guò)夜的。

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2樓2013-12-23 23:36:25

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sxxuan

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-12-24 12:10:04

很少主動(dòng)地滅活酶
一來(lái)是純化的時(shí)候可以去除，二來(lái)如果割膠的話加入電泳buffer也可以把酶失活的

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4樓2013-12-24 09:26:16

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kongzhen1985

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因?yàn)槲沂且鲋亟M酶方面的。說(shuō)明書(shū)上是酶切完后直接熱失活就可以用于重組反應(yīng)，所以擔(dān)心純化后會(huì)損失一部分的，如果是這樣那我還是回收一下吧，怕影響后續(xù)的重組反應(yīng)，謝謝大家的幫忙了。還有有做重組方面的蟲(chóng)友能交流下嗎？

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5樓2013-12-24 09:52:12

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