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ptccc銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
PET-32A重組質(zhì)粒構(gòu)建 已有2人參與
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| 最近在重組質(zhì)粒，遇上很多問題。首先就是我每次抽提質(zhì)粒的濃度總是很低。然后我那濃度低的質(zhì)粒雙酶切（Ecor1和xho1)后和目的基因連接。挑菌后菌液PCR，條帶比較弱，我擔(dān)心是假陽性，就抽提質(zhì)粒后用帶目的基因的引物做了PCR，條帶很亮，大小也對。然后雙酶切了，目的基因片段附近有點(diǎn)弱弱的條帶，我還不放心，就拿空質(zhì)粒和我認(rèn)為的重組質(zhì)粒跑了膠，一看，重組質(zhì)粒比較大，而且大小片段應(yīng)該對。。然后測序。測序結(jié)果是空質(zhì)粒�。。。。。。。。。�！我該怎么辦？從哪開始重做？？ |
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luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2013-12-26 08:29:38
ptccc: 金幣+4, ★★★★★最佳答案, 謝謝~ 2013-12-26 21:42:58
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1.提質(zhì)粒濃度低 有可能是你提質(zhì)粒沒提好，細(xì)胞壁沒破開，如果手提質(zhì)粒不熟練就用試劑盒吧，也有可能是你保存質(zhì)粒的菌染菌了~，接菌的培養(yǎng)基加抗性了嗎？如果在加抗性的培養(yǎng)基里搖出來的菌提質(zhì)粒還是濃度低，那就用你提出來的濃度低的質(zhì)粒用不同的宿主菌再重新轉(zhuǎn)化一下，保存質(zhì)粒的菌株是JM109還是DH5a？？ 2.你用濃度很低的質(zhì)粒和基因同時(shí)雙酶切后處理了嗎，比如割膠回收或者純化？？還是直接混在一起酶連了？ 3.酶連后轉(zhuǎn)化，你的感受態(tài)細(xì)胞做的怎么樣？涂板的平板抗性加夠了嗎？？挑出來的轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒濃度還低？你平板上的轉(zhuǎn)化子長得怎么樣，整個(gè)平板上都是小的單菌落轉(zhuǎn)化子嗎？你從你的篩選平板上挑單菌落接試管的同時(shí)扎板保存了嗎？扎的板子上的菌落長得怎么樣？ 4.你用PCR來驗(yàn)證重組質(zhì)粒只能說明你的轉(zhuǎn)化子里的質(zhì)粒里含有重組質(zhì)粒，而不能證明純度，你雙酶切后目的條帶處很弱有兩個(gè)可能：一是你雙酶切處理的不徹底，就是酶切時(shí)間不夠長，再者就是你的質(zhì)粒不純，咱們跑的瓊脂糖凝膠是有個(gè)分辨率的，膠上看不見的不一定沒有。從測序結(jié)果上也可以看出這一點(diǎn)。~因此，你從轉(zhuǎn)化子里提的質(zhì)粒是重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的混合物，~而且你的重組質(zhì)粒貌似要比空載的多一些~~ 解決的辦法很簡單，就拿你從轉(zhuǎn)化子里提的質(zhì)粒重新做一下轉(zhuǎn)化，換個(gè)宿主菌做感受態(tài)，以前是BL21的話可以先用個(gè)DH5a或者JM109（你一定要確認(rèn)你的菌沒有染雜菌），轉(zhuǎn)化后涂板再篩一次轉(zhuǎn)化子，一定要挑單菌落~再提一下質(zhì)�？纯�，如果跑的膠很亮，大小也對（想做酶切驗(yàn)證也可以），就可以送測序，轉(zhuǎn)化子就可以保存?zhèn)�甘油管這樣重組質(zhì)粒就保存好了，如果想表達(dá)直接提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21就行了，順便說一句，從LZ描述的情況看，你的菌有必要做個(gè)全面篩查，我估計(jì)你保存的好多菌都不太可靠特別是BL21，實(shí)在不行就扔了問別人借一下 |
4樓2013-12-26 02:06:38
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2樓2013-12-26 00:18:00
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5樓2013-12-26 02:11:41
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2013-12-26 08:29:44
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pET系列的表達(dá)載體不是高拷貝質(zhì)粒，所以質(zhì)粒濃度不高是正常的。你可以多收些菌裂解，用一個(gè)柱子吸附，應(yīng)該得到濃度可以的質(zhì)粒。 如果你確定重組質(zhì)粒沒有問題，有可能是測序的事情，一般多送幾個(gè)克隆。鑒定時(shí)雙酶切和單酶切都要做，同時(shí)用空載體做對照。雙酶切看到目標(biāo)條帶，單酶切后重組質(zhì)粒比空載體大，并與marker的分子量進(jìn)行比對。未經(jīng)酶切的質(zhì)粒大小不好與marker比較。 |
6樓2013-12-26 03:31:41
ptccc
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