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摩羯的心

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[交流] 基因組DNA模板質(zhì)量對(duì)PCR有什么影響

各位親基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其質(zhì)量對(duì)其有什么影響？我提取的基因組DNA跑電泳，只出現(xiàn)一條細(xì)細(xì)規(guī)則的條帶，感覺(jué)t提的還挺不錯(cuò)的，但測(cè)濃度純度的時(shí)候，OD260/OD280比值卻大于2，有的甚至是3或4，提取的時(shí)候加入了RNase，電泳也沒(méi)看到RNA條帶，用這樣的基因組DNA擴(kuò)增PCR，擴(kuò)增不出目的條帶，各位大神幫忙分析一下吧謝謝啦

[ Last edited by silicare on 2014-2-19 at 11:33 ]

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1樓 2013-12-30 19:29:56

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摩羯的心

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6樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 01:50:40
PCR對(duì)基因組模板的純度要求不高，通常含有少量鹽、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280過(guò)高，超過(guò)2，可能是核酸儀出了問(wèn)題。如果跑電泳條帶中無(wú)RNA，應(yīng)該不是RNA的問(wèn)題了。如果P不出來(lái)，可能有很多原因，模板用量是否正 ...

我先在遇到一個(gè)相當(dāng)讓我捉摸不透的問(wèn)題，同樣的引物，體系也一樣，只是模板不一樣，卻有的在64度退火溫度能P出目的條帶，有的在56度能P出目的條帶，請(qǐng)問(wèn)這是什么原因造成的呢

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7樓2013-12-31 08:20:10

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cicelyzh

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摩羯的心(金幣+1): 謝謝參與
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-12-31 12:45:50

PCR對(duì)基因組模板的純度要求不高，通常含有少量鹽、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280過(guò)高，超過(guò)2，可能是核酸儀出了問(wèn)題。如果跑電泳條帶中無(wú)RNA，應(yīng)該不是RNA的問(wèn)題了。如果P不出來(lái)，可能有很多原因，模板用量是否正確？（跑電泳可見(jiàn)，說(shuō)明濃度還不錯(cuò)，需要稀釋后再P）。引物的退火溫度選得是否合適？PCR體系建立是否有問(wèn)題等。

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6樓2013-12-31 01:50:40

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-12-31 14:15:33

引用回帖:

7樓: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-31 08:20:10
我先在遇到一個(gè)相當(dāng)讓我捉摸不透的問(wèn)題，同樣的引物，體系也一樣，只是模板不一樣，卻有的在64度退火溫度能P出目的條帶，有的在56度能P出目的條帶，請(qǐng)問(wèn)這是什么原因造成的呢...

是P出同樣的條帶嗎？一對(duì)引物通常能夠在較大的退火溫度范圍下都有不錯(cuò)的擴(kuò)增，所以56-64°C都可以P出來(lái)的情況也是正常的。還有可能是由于模板中的鹽濃度不同而造成退火溫度差異。通常提gDNA的protocol里的buffer通常含有一定濃度的NaCl，如果沉淀DNA時(shí)加入了醋酸鈉，都會(huì)引入高濃度的鈉離子。引物的退貨溫度與鈉離子濃度有關(guān)。

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8樓2013-12-31 12:58:39

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achonghello

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★
摩羯的心(金幣+1): 謝謝參與

目的條帶大不大？退貨時(shí)間啊溫度啊什么的都調(diào)調(diào)試試看。。。

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9樓2013-12-31 13:50:13

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