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摩羯的心

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[求助] 用擴(kuò)增cDNA的引物擴(kuò)增基因組DNA 已有7人參與

各位親們，我之前用來(lái)擴(kuò)增cDNA的引物用來(lái)擴(kuò)增基因組DNA，剛開(kāi)始的時(shí)候能得到一條目的條帶，但之后幾次，同樣的條件下，不同的DNA樣品，有的會(huì)出現(xiàn)一條目的條帶，但有的除了目的條帶外還會(huì)出現(xiàn)好多條條帶，其中提取基因組DNA時(shí)沒(méi)有加入RNA酶，將測(cè)得序列比對(duì)后，以cDNA為模板和以DNA為模板的序列比對(duì)結(jié)果相似性為99%，但現(xiàn)在我不知道是為什么會(huì)有的出現(xiàn)那么多條帶，PCR條件都是一樣的。各位大神幫幫忙吧~不勝感激

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1樓 2013-12-10 21:10:32

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11樓2013-12-12 06:47:15

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cicelyzh

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如果你的引物不跨內(nèi)含子，用cDNA為模板與gDNA為模板p出來(lái)的序列理論上是完全相同的。出現(xiàn)多條帶的原因可能是引物的特異性不強(qiáng)，與加不加RNA酶處理gDNA無(wú)關(guān)，因?yàn)镈NA聚合酶是不能以RNA為模板的，RNA只有反轉(zhuǎn)錄成cDNA才能做PCR。

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2樓2013-12-11 09:34:00

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:34:00
如果你的引物不跨內(nèi)含子，用cDNA為模板與gDNA為模板p出來(lái)的序列理論上是完全相同的。出現(xiàn)多條帶的原因可能是引物的特異性不強(qiáng)，與加不加RNA酶處理gDNA無(wú)關(guān)，因?yàn)镈NA聚合酶是不能以RNA為模板的，RNA只有反轉(zhuǎn)錄成cDNA ...

引物不跨內(nèi)含子意思是指引物在一個(gè)外顯子里是嗎？如果引物特異性不好，為什么剛開(kāi)始做的時(shí)候都只是批出了一條目的條帶，第二次做的時(shí)候出現(xiàn)好多條帶的情況，這應(yīng)該不是引物特異性不好的原因吧？還有就是之前用這條引物擴(kuò)增cDNA也只是出現(xiàn)一條條帶，如果引物特異性不好，那不是應(yīng)該也會(huì)出現(xiàn)好多條帶嗎？麻煩幫我解答一下吧

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3樓2013-12-11 15:23:47

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基因組的信息量比cDNA的信息量大的多，所以你的引物針對(duì)于基因組DNA特異性可能沒(méi)那么好，你可以去UCSC網(wǎng)站分析下你的引物質(zhì)量

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4樓2013-12-11 15:39:57

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你幾次的擴(kuò)增條件是一樣的嗎？第二次的模板或者引物濃度都一樣嗎。只要沒(méi)有內(nèi)含子，擴(kuò)出來(lái)的都一樣�；蚪M東西多，有雜帶也正常

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5樓2013-12-11 16:03:00

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5樓: Originally posted by 竹子小小 at 2013-12-11 16:03:00
你幾次的擴(kuò)增條件是一樣的嗎？第二次的模板或者引物濃度都一樣嗎。只要沒(méi)有內(nèi)含子，擴(kuò)出來(lái)的都一樣。基因組東西多，有雜帶也正常

除了模板濃度不一樣，其他的條件都一樣，請(qǐng)問(wèn)基因組PCR中模板的量一般是多少，我一般都是加入2ul，模板濃度一般為多少啊

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6樓2013-12-11 16:19:48

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4樓: Originally posted by dongge2013 at 2013-12-11 15:39:57
基因組的信息量比cDNA的信息量大的多，所以你的引物針對(duì)于基因組DNA特異性可能沒(méi)那么好，你可以去UCSC網(wǎng)站分析下你的引物質(zhì)量

親能具體說(shuō)一下怎么用UCSC網(wǎng)站分析引物質(zhì)量嗎？還有如果是引物不好，那為什么有的能擴(kuò)出一條帶，而有的擴(kuò)出很多條帶來(lái)呢

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7樓2013-12-11 16:22:32

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這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵是cDNA序列中不包含內(nèi)含子，而基因組中含內(nèi)含子，因此設(shè)計(jì)擴(kuò)增cDNA的引物用來(lái)擴(kuò)增基因組DNA時(shí)，必須考慮內(nèi)含子的位置。

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8樓2013-12-11 16:28:26

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8樓: Originally posted by Genseer at 2013-12-11 16:28:26
這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵是cDNA序列中不包含內(nèi)含子，而基因組中含內(nèi)含子，因此設(shè)計(jì)擴(kuò)增cDNA的引物用來(lái)擴(kuò)增基因組DNA時(shí)，必須考慮內(nèi)含子的位置。

但就算是引物跨內(nèi)含子那不是也只會(huì)擴(kuò)增到的目的條帶比理論上的片段長(zhǎng)，也不會(huì)出現(xiàn)這么多條雜帶吧？還有我擴(kuò)增到的目的條帶測(cè)序后與設(shè)計(jì)引物所用的mRNA序列相似性為99%，那這樣是不是說(shuō)明，這個(gè)基因沒(méi)有內(nèi)含子呢？

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9樓2013-12-11 17:11:29

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3樓: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-11 15:23:47
引物不跨內(nèi)含子意思是指引物在一個(gè)外顯子里是嗎？如果引物特異性不好，為什么剛開(kāi)始做的時(shí)候都只是批出了一條目的條帶，第二次做的時(shí)候出現(xiàn)好多條帶的情況，這應(yīng)該不是引物特異性不好的原因吧？還有就是之前用這條 ...

是的。一般設(shè)計(jì)RT-PCR時(shí)的引物會(huì)設(shè)計(jì)在不同外顯子里，這樣很容易區(qū)分gDNA擴(kuò)增產(chǎn)物和cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
引物特異性好不好不僅和引物有關(guān)，也和擴(kuò)增的模板有關(guān)。設(shè)計(jì)引物時(shí)一般要根據(jù)模板來(lái)blast。此外，PCR條件控制不嚴(yán)格也可能產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

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10樓2013-12-12 02:19:09

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