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做細(xì)菌的雙重?zé)晒鈖cr 已有1人參與
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請(qǐng)問(wèn)做2種細(xì)菌的雙重?zé)晒鈖cr，我用的是菌種，必須要制備標(biāo)準(zhǔn)品嗎（進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將目的片段克隆于pMD18-T， 構(gòu)建重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR分析和測(cè)序驗(yàn)證）？必須要這一步嗎？ 如果不制備標(biāo)準(zhǔn)品，直接提取菌種DNA，然后并利用OD260nm/OD280nm比值來(lái)確定DNA的純度，然后進(jìn)行梯度稀釋，測(cè)檢測(cè)限，這樣可以嗎？ |
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sxxuan
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5樓2014-01-02 10:28:28
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6樓2014-01-02 10:30:21
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1. 熒光pcr的擴(kuò)增長(zhǎng)度最好控制在80-150bp，這樣效果最好，所以引探的設(shè)計(jì)都是在特定基因的某個(gè)區(qū)域而并非全長(zhǎng)。因此用熒光pcr的上下游引物來(lái)擴(kuò)增并不一定能得到目的基因。 2. 如果是做克隆例如質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品，光從PCR擴(kuò)增，不計(jì)算設(shè)計(jì)引物和合成的時(shí)間，大概需要一周。 3. 如果文獻(xiàn)中的基因是你要做的，序列也是完全一樣的，或者是這段序列涵蓋了你的熒光引探區(qū)域，可以直接用文獻(xiàn)中的引物序列。 |
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a32006498樓2014-01-02 10:46:01
sxxuan
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13樓2014-01-03 11:58:45
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| 看看你的目的是什么，如果只是看看熒光的，有沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品都無(wú)所謂。但是涉及到發(fā)文章論文之類的，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品誰(shuí)確定你檢測(cè)出的熒光就是你說(shuō)的哪個(gè)？起碼有個(gè)對(duì)照。 |
2樓2014-01-02 09:30:51
3樓2014-01-02 09:37:42
4樓2014-01-02 09:40:23
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謝謝，再請(qǐng)教你3個(gè)問(wèn)題，1.我用熒光pcr設(shè)計(jì)的引探中的引物來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)品前期的pcr擴(kuò)增的引物是不是不可以�。�(tīng)老師說(shuō)是熒光pcr的引物擴(kuò)增出來(lái)的DNA要比普通的引物pcr的要短） 需要從新設(shè)計(jì)一段普通pcr的引物 2.這個(gè)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品大約需要多少時(shí)間做的完�。◤臄U(kuò)增，到測(cè)序得到標(biāo)準(zhǔn)品）？我是新手，不太會(huì)！ 3.我可不可以用其他文獻(xiàn)的針對(duì)細(xì)菌某特異性基因的引物（例如 李斯特菌的hly特異性基因）來(lái)設(shè)計(jì)作為我該細(xì)菌普通pcr的引物呢？ 謝謝  |
7樓2014-01-02 10:38:56
9樓2014-01-02 11:05:26
sxxuan
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