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哈哈善哉善哉

新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 發(fā)育生物學(xué)

[交流] 求高手幫助，關(guān)于定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)

我想設(shè)計(jì)某個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變引物，但是由于序列的GC含量很高，所以引物自身二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)很多，自由能最高的為-6.8，我想請問有沒有辦法可以解決這個(gè)問題，因?yàn)樾蛄袩o法變，所以真的沒辦法了
還有點(diǎn)突變的引物一定要在30個(gè)堿基左右么，Tm值真的太高了
請各位高手一定幫幫忙，萬分感謝！�。�
因?yàn)槭堑谝淮巫鲞@方面的，所以我想請問下，如果不用試劑盒，那么需要哪些試劑，步驟大概是什么？
之前看一些點(diǎn)突變試劑盒的說明書，要求不一樣，所以如果我不用試劑盒那么引物的設(shè)計(jì)依據(jù)是怎樣的呢？
點(diǎn)突變的堿基位置均在上下游引物的中間么，還是一條在中間，另一條在最末端？
舉個(gè)例子，之前看到過兩種情況
1.cgagcagtagGtagcgatagtt 2. GCGGCTCGTG CCGCCGgCCGTCGCCGA
gctcgtcatcCatcgctatcaa AGCCCGACCG CGCCGAGCAC GGCGGCc
到底哪種是可行的呢？
還有還有，很多都說Tm要大于78，這么高的退火溫度可怎么進(jìn)行延伸啊，能p成功么，還是說這是試劑盒要求的，不用試劑盒就不能使Tm過高？

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1樓 2014-01-02 16:20:56

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