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哈哈善哉善哉新蟲 (初入文壇)
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[交流]
求高手幫助，關(guān)于定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)
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我想設(shè)計(jì)某個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變引物，但是由于序列的GC含量很高，所以引物自身二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)很多，自由能最高的為-6.8，我想請(qǐng)問(wèn)有沒(méi)有辦法可以解決這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樾蛄袩o(wú)法變，所以真的沒(méi)辦法了 還有點(diǎn)突變的引物一定要在30個(gè)堿基左右么，Tm值真的太高了 請(qǐng)各位高手一定幫幫忙，萬(wàn)分感謝�。。� 因?yàn)槭堑谝淮巫鲞@方面的，所以我想請(qǐng)問(wèn)下，如果不用試劑盒，那么需要哪些試劑，步驟大概是什么？ 之前看一些點(diǎn)突變?cè)噭┖械恼f(shuō)明書，要求不一樣，所以如果我不用試劑盒那么引物的設(shè)計(jì)依據(jù)是怎樣的呢？ 點(diǎn)突變的 堿基位置均在上下游引物的中間么，還是一條在中間，另一條在最末端？ 舉個(gè)例子，之前看到過(guò)兩種情況 1.cgagcagtagGtagcgatagtt 2. GCGGCTCGTG CCGCCGgCCGTCGCCGA gctcgtcatcCatcgctatcaa AGCCCGACCG CGCCGAGCAC GGCGGCc 到底哪種是可行的呢？ 還有還有，很多都說(shuō)Tm要大于78，這么高的退火溫度可怎么進(jìn)行延伸啊，能p成功么，還是說(shuō)這是試劑盒要求的，不用試劑盒就不能使Tm過(guò)高？ |
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