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酵母基因敲除，PCR驗(yàn)證遇到的問題。 已有4人參與
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這是我的PCR驗(yàn)證酵母基因敲除（方法就是常用的同源重組法，醋酸鋰轉(zhuǎn)化）泳道1出現(xiàn)的是從pUG6擴(kuò)增disruption cassette 的一對引物，2-5泳道是A-B，6-9泳道是C-D，10-13泳道是A-D，（其中A、D是目的基因兩側(cè)的引物，B、C是目的基因內(nèi)部的引物，B-M、C-M是marker內(nèi)部的引物）不過，A、B-M和C-M、D并沒有條帶，所有樣品都是用酵母菌液（凍融處理）作為模版。 我的問題是，我的A-D條帶大小說明目的基因還在，且A-B，C-D的條帶也說明了這點(diǎn)，但是為什么我的泳道1還有大小與我的disruption cassette 相同的條帶呢？而且我今天做了個disruptionF，B-M和C-M，disruptionR兩對引物，都有大小與預(yù)期相同的條帶。說明disruption cassette 已經(jīng)在酵母細(xì)胞中了。。。沒有發(fā)生同源重組？ 各位分析一下什么情況…… yeast2 編輯.jpg |
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三蟄(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵交流 2014-03-02 10:58:33
三蟄(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵交流 2014-03-02 10:58:33
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我也是遇到同樣的問題，轉(zhuǎn)化后的酵母在抗性板上張得很歡快，可是PCR驗(yàn)證就是不對，我判斷是發(fā)生了非同源交換，情況和你的很像。 不知道你現(xiàn)在情況如何了？我現(xiàn)在是想多做幾次看看能不能成，我的同源部分各有700BP，我覺得發(fā)生非同源的概率太不可思議了，文獻(xiàn)中的報道都是差不多的做法……感覺做起來特別無力……共勉吧……希望你成功（PS。我現(xiàn)在想再擴(kuò)大同源的部分，不知道能不能成。） |
10樓2014-02-26 22:23:49
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