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jmh5d銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
連接轉(zhuǎn)化的問題 已有2人參與
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| 做了幾次連接轉(zhuǎn)化都不行，沒有菌落，培養(yǎng)基上光禿禿的。我連接是5ul體系，4ul回收產(chǎn)物1ulPEASK-T3,25度20min，pcr控溫。感受態(tài)用的天根的T1。小白求助啊。馬上要過年了回收的DNA也快2星期了，一直-20放著，年前不行的話就悲催了。我是想測序，單純的就是測DNA序列，大概3000bp左右。求大神指導(dǎo)問題出哪或者方法步驟借鑒給小弟一下，謝啦 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流！ 2014-01-08 11:45:55
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看你用的是T1載體，估計(jì)應(yīng)該是用pEASY載體，這個(gè)方法很成熟也比較容易，看看你是否忽略了以下幾點(diǎn)： 1，你PCR時(shí)用的Taq酶能否在產(chǎn)物的3‘端產(chǎn)生polyA末端； 2，平板抗性（一般是Amp），是否過量。 3，有時(shí)候感受態(tài)細(xì)胞很脆弱，如果出現(xiàn)過反復(fù)凍融最好不用了，也就是看一看感受態(tài)的質(zhì)量。 4，最重要的一點(diǎn)，你的轉(zhuǎn)化操作可能出現(xiàn)了問題：因?yàn)椴徽撃闶欠襁B接成功（就算出現(xiàn)轉(zhuǎn)化后的載體自連），只要轉(zhuǎn)化成功，就會(huì)有菌落在抗性板子上生長。 總之，3和4是你要重點(diǎn)考慮的。 |
jmh5d2樓2014-01-08 10:17:33
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